第三篇：CHO细胞宿主蛋白(CHO-HCP)酶联免疫分析试剂盒使用说

Vero 细胞HCP（宿主细胞蛋白）Vero细胞宿主蛋白酶联免疫检测目录#F500预期用途该试剂盒用于检测用Vero 细胞.生产的制品中是否有宿主蛋白残留。

仅供研究和工业生产，不能用于人和动物的诊断。

总结与说明病毒疫苗或其他治疗用蛋白在Vero细胞中表达使商业用大量生产药物原料产品的经济简便方法。

生产和纯化这些产品的过程中会残留Vero细胞中的一些蛋白质（称为宿主细胞蛋白，HCPs）而造成污染。

这种污染可以减少药物的疗效，引发毒副反应和免疫学反应，因此最好在实际生产制品过程中将HCPs降低到最低水平。

一些利用抗体来除HCPs的免疫学方法，如Western Blot 和ELISA被广泛使用。

虽然Western blot是一种检测HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。

因为它过程复杂且技术依赖性强，需要操作者对结果进行分析解释。

而且，它在本质上是一种定性检测，不能定量分析。

Western blot的敏感性易受被检测样品量的影响，也受目的产品浓度的干扰。

因此Western blot可用来检测纯化上游的蛋白质，而对纯化下游或终产品的检测灵敏度与特异性较低。

本试剂盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺点，将敏感度提高了100倍。

ELISA操作简单、客观、可获得半定量的结果，是纯化工艺，过程控制，常规质量检测的最佳选择。

这个试剂盒可与纯化过程中残留的可独立污染产品的所有HCPs反应，就这个意义上来说，这个试剂盒是通用的。

用Vero细胞轻度裂解物获得抗体并经亲和纯化，得到的最终抗体可以与用于生产各种病毒疫苗和蛋白质产品的四种商用细胞系反应。

这一分析表明，绝大多数HCP存在于各种Vero细胞系和纯化过程中。

如果你需要一个更为敏感和特异性的方法去检测样品中的HCP量，Cygnus Technologies公司为你推荐一个优于2D Western blot的方法，我们将这个方法称为2D HPLC-ELISA。

百泰派克生物科技HCP宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白（HCP，Host Cell Protein）是在生物制药（如生产重组蛋白药物、单克隆抗体）工艺过程中所产生的杂质，其超过一定含量则很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。

因此，HCP残留量检测是抗体药物产品研发与质控中最常进行的分析项目，HCP残留数值越低，则产品质控越好。

宿主细胞蛋白（HCP）是由宿主细胞产生的与工艺相关的杂质，通常在重组生物制药产品中的含量较低，即使HCP杂质的总含量很低同样也可能对药物的性质造成不良影响。

对于患者而言，HCP是异源蛋白，通常大部分异源蛋白都可能具有免疫原性，因此即使很低浓度的HCP也可能引发不良免疫反应。

宿主细胞的HCP中也包含一些蛋白水解活性酶，可使目的蛋白发生片段化，从而导致总产品降低。

除了会导致目的蛋白降解和片段化以外，HCP还会导致蛋白聚集等种种不良影响。

因此，需对产品中的HCP进行监测和控制，以支持对治疗性蛋白产品中HCP相关风险的评估和控制。

通常，在治疗性蛋白的生产中用得最多的HCP检测方法为酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法可以采用多克隆抗体直接量化分析HCP的总体丰度。

然而，一般无法采用此法快速定量分析单个HCP组分，且可能检测不到免疫原性较弱或非免疫原性的HCP。

当前已开发出多种互补的分析用于监测HCP，包括1D/2D-PAGE、基于质谱（MS）的等分析技术。

其中，液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）可同时鉴定和定量分析HCP杂质，是ELISA的主要互补分析方法。

百泰派克生物科技提供生物制药分析服务，其中包括宿主蛋白残留（HCP）分析服务。

百泰派克生物科技有经验丰富的技术人员，可以提供从实验设计、样品检测、数据分析等全套专业服务，可精准检测生物药物可能残留的宿主蛋白。

人C-jun酶联免疫分析试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T3U/L – 80U/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中C-jun含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C-jun水平。

用纯化的人C-jun抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-jun，再与HRP标记的C-jun抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的C-jun呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人C-jun浓度。

试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

人C反应蛋白（CRP）ELISA分析检测试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中转化生长因子（CRP）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C反应蛋白（CRP）水平。

用纯化的转化生长因子（CRP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入转化生长因子（CRP），再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的转化生长因子（CRP）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人C反应蛋白（CRP）浓度。

试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）塑料膜板盖1块半块标准品：100ng/ml 1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记的抗OT抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml）1瓶（5ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）试剂盒组成：3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

人C反应蛋白ELISA检测试剂盒操作步骤：1. 使用前，将所有试剂充分混匀。

不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。

每个标准品和空白孔建议做复孔。

每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加入稀释好后的标准品50ul 于反应孔、加入待测样品50 ul 于反应孔内。

宿主细胞蛋白(HCP)检测方法及其原理HCP（Host Cell Proteins，宿主细胞蛋白）是指生物制品生产过程中，来自生产用细胞的蛋白质杂质。

例如，当使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）生产重组蛋白时，除了目标蛋白外，还可能有一些CHO细胞本身的蛋白存在于最终产品中。

这些HCP可能会影响产品的稳定性、效力或安全性，因此需要进行检测和控制。

以下是HCP检测的常用方法及其原理：1、ELISA (酶联免疫吸附测定法)（1）原理：特异性抗HCP抗体被固定在酶标板上。

待测样品中的HCP与抗体结合，然后再加入与HCP结合的酶标记的二抗。

通过测定酶的活性，可以间接测量HCP的含量。

（2）优点：灵敏，可以量化HCP的总量。

（3）缺点：需要高质量的抗HCP抗体，可能不检测到所有的HCP杂质。

图1。

2、质谱法（1）原理：利用质谱仪检测和鉴定样品中的蛋白质。

（2）优点：可以鉴定具体的HCP种类，高分辨率。

（3）缺点：技术要求高，成本较高，数据处理复杂。

3、免疫印迹 (Western Blot)（1）原理：先通过凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到膜上，并使用特异性抗HCP抗体检测目标HCP。

（2）优点：可以鉴定和定量特定的HCP。

（3）缺点：只能检测到与使用的抗体有反应的HCP。

4、二维凝胶电泳 (2D-PAGE)（1）原理：通过两个方向的凝胶电泳分离蛋白，一维按等电点，二维按分子量，形成蛋白质的二维图谱。

（2）优点：可以观察到样品中所有蛋白的分布。

（3）缺点：技术要求高，不能直接量化。

在生物制品的开发和生产中，通常会结合多种方法来检测和控制HCP，以确保产品的质量和安全性。

1、 检验申请单独检验项目申请：人类免疫缺陷病毒抗体{缩写抗HIV （1+2）]测定。

临床医生根据需要提出检验申请。

2、 标本采集与处理2.1标本采集2.1.1常规静脉采血约2ml ，不抗凝，置普通试管中，或采用含分离胶的真空采血管。

也可采集血浆，用肝素、EDTA 或枸橼酸盐抗凝。

2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。

2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。

2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。

专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。

2.1.5下列标本为不合格标本2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml 的全血标本，或少于0.1ml 的血清或血浆。

2.1.5.2对检测结果可能有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。

2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。

2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。

2.2标本保存2.2.1接收标本后在置1-2h 后将标本离心分离出血清或血浆，避免溶血。

离心必须达到3000rpm 15min ，离心后的血清中不能含有颗粒物和微量纤维蛋白。

2.2.2标本保存时间：室温（15-25℃）下可稳定48h ，普通冰箱中（2-8℃）稳定7d ，在-20℃最多可保存4周。

避免反复冻融。

不可使用热灭活的标本。

2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4-8℃冰箱内保存7d 。

2.3标本采集的注意事项采血前使受检者保持平静、松弛，避免剧烈活动。

医院检验科免疫室 体诊断试剂盒（酶联免疫法）标准操作规程 生效日期： 年 月 日版本：第1版第 页，共 页3．方法原理本实验采用HIV 特异性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。

当待测标本中存在HIV 抗体时，该抗体和固化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB 底物参与反应的情况下，产生显色反应。

大鼠泰泽病原体(CP）ELISA试剂盒操作说明大鼠泰泽病原体(CP）ELISA试剂盒操作说明大鼠泰泽病原体(CP）ELISA试剂盒实验原理大鼠泰泽病原体(CP）ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被大鼠泰泽病原体(CP）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的大鼠泰泽病原体(CP）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样本处理及要求1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。

将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。

推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。

为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。

最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂盒器材1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱4.蒸馏水或去离子水1、标准品浓度依次为：详见说明书；2、经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。

宿主细胞蛋白hcp介绍：蛋白质等电点测定方法分析宿主细胞蛋白（Host Cell Protein，简称HCP）是指在生物制药过程中，由宿主细胞表达的与目标蛋白质无关的杂质蛋白质。

这些HCP可能会影响药物的质量、安全性和疗效，因此对HCP进行分析和控制是生物药物研发和生产过程中的重要环节。

1. HCP的来源和影响HCP主要来源于宿主细胞中的内源性蛋白质，包括细胞骨架、代谢酶、转录因子等。

这些蛋白质在生产过程中可能会被宿主细胞表达，并与目标蛋白质一同分泌到培养基中。

由于HCP与目标蛋白质的结构和功能不同，其存在可能会对药物的质量和稳定性产生不利影响。

图1。

2. 蛋白质等电点测定方法分析蛋白质等电点测定方法是一种常用的分析方法，用于确定蛋白质的等电点（Isoelectric Point，简称pI）。

蛋白质的等电点是指在特定条件下，蛋白质带有净电荷的pH值。

通过测定蛋白质的等电点，可以帮助我们了解蛋白质的电荷性质，从而更好地进行HCP的分析和控制。

3. 蛋白质等电点测定方法图 2。

目前常用的蛋白质等电点测定方法包括等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）和等电点电位测定法（Isoelectric Point Electrophoresis，简称IEP）。

这两种方法都是基于蛋白质在不同pH值下的电荷性质进行分析。

3.1 等电聚焦电泳（IEF）。

等电聚焦电泳是一种基于蛋白质在电场中的迁移速率与其净电荷量之间的关系进行分析的方法。

在等电聚焦电泳中，蛋白质样品被加载到一个具有梯度pH值的凝胶中，然后通过电场进行分离。

在特定的pH值下，蛋白质的净电荷为零，停留在相应的位置，形成等电点聚焦带。

通过观察等电点聚焦带的位置，可以确定蛋白质的等电点。

3.2 等电点电位测定法（IEP）。

等电点电位测定法是一种通过测定蛋白质在不同pH值下的电位变化来确定其等电点的方法。

在等电点电位测定中，蛋白质样品被溶解在缓冲液中，然后通过改变缓冲液的pH值，测定蛋白质溶液的电位变化。

人和肽素(CPP)酶联免疫检测试剂盒使用说明书使用前仔细阅读本说明书。

本酶联免疫试剂盒是基于生物素双抗体夹心技术原理，来检测人和肽素(CPP))，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

用途：用于人血清、血浆及相关液体样本中和肽素(CPP)的测定。

工作原理本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人和肽素(CPP)的水平。

向预先包被了人和肽素(CPP)单克隆抗体的酶标孔中加入和肽素(CPP)，温育；温育后，加入生物素标记的抗CPP抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅与样品中人和肽素(CPP)的浓度呈正相关。

试剂盒组成需要而未提供的试剂和器材1．37℃恒温箱。

2．标准规格酶标仪。

3．精密移液器及一次性吸头4．蒸馏水，5．一次性试管6．吸水纸注意事项1．从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。

酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

3．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

4．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5．不用的其它试剂应包装好或盖好。

不同批号的试剂不要混用。

保质前使用。

6．底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。

根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

标本要求1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融操作程序1．标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比2复孔。