钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。

藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。

每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。

冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。

可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。

我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。

2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。

从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。

实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。

由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。

第53卷 第12期 2023年12月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A53(12):061~070D e c .,2023钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究❋毕 莹,郭雅琳,尚孟慧,徐晓婷,臧晓南❋❋(中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003)摘 要: 为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(A r t h r o -s p i r a p l a t e n s i s F A C H B 314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因a p c A B 及其亚基基因a p c A 和a p c B ㊂节旋藻基因组中a pc A B 全长共1056b p ,由a p c A 和a p c B 串联组成,中间间隔84b p ㊂其中,a p c A 和a pc B 基因的全长均为486b p ,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33k D a ,它们分别编码的α和β亚基均属于G l o b i n _l i k e 超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守㊂将克隆出的亚基基因a p c A ㊁a p c B 分别同前期A .p l a t e n s i s F A C H B 314中获得的藻蓝胆素合成相关基因h o 和p c y A 以及色基裂合酶基因(c p c E ㊁c p c F ㊁c p c U ㊁c p c S ㊁c pc T )共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E .c o l i H P E F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B ㊂S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基㊂荧光检测结果显示,在600n m 波长激发下,两株重组菌株在640n m 处均出现了别藻蓝蛋白特征荧光发射峰㊂这些结果表明在重组大肠杆菌中表达的脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基可以和藻蓝胆素结合,形成有光学活性的别藻蓝蛋白,这为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药㊁荧光检测方面的应用奠定了基础㊂关键词: 节旋藻;别藻蓝蛋白基因;重组表达;荧光活性中图法分类号: Q 946 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2023)12-061-10D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220103引用格式: 毕莹,郭雅琳,尚孟慧,等.钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2023,53(12):61-70.B i Y i n g ,G u o Y a l i n ,S h a n g M e n g h u i ,e t a l .C l o n i n g ,a n a l y z i n g a n d h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f a l l o p h y c o c ya n i n g e n e f r o m A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s F A C H B 314[J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a ,2023,53(12):61-70. ❋ 基金项目:国家自然科学基金项目(31872555)资助S u p p o r t e d b yt h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a (31872555)收稿日期:2022-02-22;修订日期:2022-03-23作者简介:毕 莹(1998 ),女,硕士生㊂E -m a i l :b i y i n g h a p pi e s t @163.c o m ❋❋ 通信作者:E -m a i l :x n z a n g@o u c .e d u .c n 钝顶节旋藻(A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s )是一种多细胞丝状的蓝绿色微藻,属于蓝藻门(C y a n o p h y t a )㊁蓝藻纲(C y-a n o p h yc e a e )㊁颤藻目(O s c i l l a t o r i a l e s )㊁颤藻科(O s c i l l a o r i a -l e s )㊁节旋藻属(A r t h r o s pi r a ),生长在水中,易被获得与加工,并且具有很高的常量与微量营养成分㊂它在作为补充膳食成分㊁蛋白质维生素补充剂和健康食品方面具有很大的发展潜力㊂其富含的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白具有很高的生物学研究价值与应用开发价值[1-2]㊂别藻蓝蛋白(A l l o p h y c o c ya n i n )作为藻胆体核心复合物中重要的藻胆蛋白,能直接吸收光能,进而作为捕光色素参与藻类的光合作用,而且在抗氧化㊁抗癌㊁免疫印迹和食品工业方面都有应用[3-5]㊂另外,别藻蓝蛋白还因具有光学活性,可作为光敏材料和生物医学中的荧光标签[6-7]㊂分离纯化出来的天然别藻蓝蛋白含有α㊁β两种亚基,通常是以三聚体(αβ)3的形式存在[8]㊂天然别藻蓝蛋白的荧光发射特征峰约在660n m左右[9],吸收峰在650n m ㊂别藻蓝蛋白之所以具有明亮的颜色和光吸收特性,是由于藻胆素(P C B s,线性四吡咯胆素)的存在,P C B s 通过硫醚键连接到藻胆蛋白高度保守的半胱氨酸残基上[10]㊂藻蓝胆素的合成需要铁氧还蛋白还原酶(P c yA )还原胆绿素,胆绿素则是由血红素氧化酶(H O 1)氧化血红素而得㊂血红素不仅存在于蓝藻中,也存在于大肠杆菌中[11]㊂因此,H O 1和P c yA 在大肠杆菌中的转化表达使带有光学活性藻胆蛋白的异源表达成为可能㊂色基裂合酶可以进一步催化藻胆素结合到脱辅基藻胆蛋白不同位点的半胱氨酸,为藻胆素的附着提供了正确的区域和异构性[12-13]㊂因此,异源表达有光学活性的别藻蓝蛋白,除了要表达脱辅基别藻蓝蛋白,还要表达藻蓝胆素合成相关酶(H O 1㊁P c yA )以及催化别藻蓝蛋白同色基结合的色基裂合酶(C p c E ㊁C p c F ㊁C p c U ㊁C p c S ㊁C pc T )㊂关于利用基因工程技术合成具有光学活性别藻蓝中国海洋大学学报2023年蛋白的研究有很多报道,主要集中在聚球藻(S y n e c h o-c o c c u s s p.7002)和集胞藻(S y n e c h o c y s t i s s p. P C C6803)模式蓝藻上[14-17]㊂节旋藻作为一种可食用的经济蓝藻,其别藻蓝蛋白被证明有显著的医药价值,对其别藻蓝蛋白进行重组表达的研究有重要的应用价值[18]㊂文献[19]的研究中,对螺旋藻(S p i r u l i n a s p.)的别藻蓝蛋白α亚基基因(A p c A)进行克隆并自催化在大肠杆菌中进行异源表达㊂G e等利用来自S y n e-c h o c y s t i s s p.P C C6803的h o1和p c y A㊁来自鱼腥藻(A n a b a e n a s p.P C C7120)的c p e S以及来自螺旋藻S p i r u l i n a s p.的a p c B基因构建表达载体,成功表达重组别藻蓝蛋白β亚基[20]㊂本研究利用分子生物学技术克隆了A.p l a t e n s i s F A C H B314中的脱辅基别藻蓝蛋白基因a p c A B并分析预测了其单亚基基因a p c A和a p c B,结合本实验室前期在同物种中得到的藻蓝胆素合成相关基因(h o1和p c y A)以及色基裂合酶基因(c p c E㊁c p c F㊁c p c U㊁c p c S和c p c T),分别构建了2个分别表达a p c A和a p c B单亚基的重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A和E.c o l i H P E-F U S T B,分析重组菌株的蛋白表达和荧光活性,为研究蓝藻中藻胆体的组装和光学活性提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药㊁荧光检测方面应用奠定基础㊂1材料和方法1.1藻种和质粒钝顶节旋藻(A.p l a t e n s i s F A C H B314)由中国海洋大学藻类遗传育种和生物技术实验室保存,培养温度为25ħ,光照周期为12Lʒ12D㊂E.c o l i B L21 (D E3)C h e m i c a l l y C o m p e t e n t C e l l购自T S I N G K E,表达载体p A C Y C D u e t-1和p E T-24a(+)购自N o v a g e n (G e r m a n y)㊂本实验室构建并保存含有A.p l a t e n s i s F A C H B314中克隆的亚铁血红素氧化酶基因(h o)㊁铁氧还蛋白还原酶基因(p c y A)以及色基裂合酶基因(c p c U㊁c p c S㊁c p c T㊁c p c E和c p c F)的p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T㊁p A C Y C D u e t-c p c E F质粒㊂1.2节旋藻基因组D N A的提取使用T A K A R A植物基因组D N A提取试剂盒(T a K a R a M i n i B E S T P l a n t G e n o m i c D N A E x t r a c t i o n K i t)提取节旋藻基因组D N A,获得的D N A置于-20ħ环境中保存㊂1.3脱辅基别藻蓝蛋白基因簇a p c A B以及a p c A、a p c B的克隆及序列分析参照在G e n B a n k数据库(h t t p://w w w.n c b i.n l m. n i h.g o v/g e n b a n k)中已报道的A.p l a t e n s i s Y Z g e-n o m e(G e n B a n k:C P013008.1)的脱辅基别藻蓝蛋白基因序列设计引物,如表1(酶切位点处以下划线表示)所示,以提取出的A.p l a t e n s i s F A C H B314基因组D N A 为模板,扩增得到脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因簇序列,连接T载体p E A S Y T1-a p c A B,对获得的序列进行测序验证㊂经分析预测设计引物(见表1),克隆脱辅基别藻蓝蛋白α亚基和β亚基分别对应的基因a p c A 和a p c B,并均连接T载体,以获得p E A S Y T1-a p c A 和p E A S Y T1-a p c B㊂表1引物设计列表T a b l e1P r i m e r s l i s t s引物名称P r i m e r n a m e引物序列P r i m e r s e q u e n c e内切酶E n d o n u c l e a s ea p c A B314-F5 -G G A T C C G A T G A G T A T C G T T A C C A A A T C C A T C G-3 B a m HⅠa p c A B314-R5 -G A G C T C T T A G C T C A A G C C A G A G C A G A T G T A A-3 S a cⅠa p c A314-F5 -G G A T C C G A T G A G T A T C G T T A C C A A A T C C A T C G-3 B a m HⅠa p c A314-R5 -G A G C T C T T A T G A C A T T G C A C C A A T T A G G T A G-3 S a cⅠa p c B314-F5 -G G A T C C G A T G C A A G A C G C A A T C A C T T C C G T A-3 B a m HⅠa p c B314-R5 -G A G C T C T T A G C T C A A G C C A G A G C A G A T G T A A-3 S a cⅠ注:下划线处为酶切位点㊂T h e s i t e s o f e n z y m e d i g e s t i o n a r e u n d e r l i n e d.对获得的单亚基基因序列进行测序验证和分析㊂通过D N A m a n软件(开发商:L y n n o n C o r p o r a t i o n, Q u e b e c,C a n a d a)确定基因的氨基酸序列,通过B L A S T程序(h t t p://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/B L A S T/)对基因的保守结构域进行分析,确定其编码框[21]㊂利用E x p e r t蛋白分析系统(h t t p://w w w.e x p a s y.o r g)对氨基酸序列进行理论等电点和分子量预测[22]㊂通过G e-n o m e(h t t p://w w w.g e n o m e.j p/t o o l-b i n/c l u s t a l w)进行多序列比对,利用M E G A7.0程序构建系统进化树[23]㊂多序列比对及构建进化对所用序列来源于N C-B I数据库(h t t p://w w w.n c b i.n l m n i h.g o v l)㊂1.4表达载体p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C-D u e t-a p c B-c p cE F的构建使用快速内切酶B a m HⅠ和S a cⅠ对得到的克隆质粒p E A S Y T1-a p c A和p E A S Y T1-a p c B分别进行双酶切,分别得到a p c A和a p c B两个片段;同时对2612期毕莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究实验室前期构建的载体p A C Y C D u e t-c p c E F同样用B a m HⅠ和S a cⅠ两个快速内切酶双酶切,然后将两个片段分别连入载体中,从而获得表达质粒p A C Y C D u-e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F㊂将重组表达载体p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F分别同实验室前期构建的含有合成藻蓝胆素相关基因的表达载体p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T共同转化至表达菌株E.c o l i B L21 (D E3)中,分别得到重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A 和E.c o l i H P E F U S T B㊂1.5重组菌株的诱导表达将表达菌株E.c o l i H P E F U S T A㊁E.c o l i H P E-F U S T B和空白对照E.c o l i B L21菌种分别接种到200m L溶菌肉汤(L B)液体培养基中于37ħ200r/m i n 条件下进行扩大培养㊂其中,表达菌株E.c o l i H P E-F U S T A㊁E.c o l i H P E F U S T B的培养基中加入抗生素硫酸卡那霉素和氯霉素(1ʒ1000),空白对照E.c o l i B L21的培养基不加抗生素㊂当吸光度(O D)达到0.6时,向重组菌液中分别加入浓度为1m o l/L的I P T G至终浓度为0.1m m o l/L㊂在30ħ200r/m i n条件下诱导重组蛋白表达4h㊂然后再次测定表达后的O D600以保证得到菌量相同㊂将相同菌量的菌液离心后,先用5m L0.9%N a C l进行溶液洗涤,再在4ħ10000r/m i n 下离心20m i n后,用4m L P B S母液重悬后,然后使用超声将其破碎6m i n,最后在4ħ10000r/m i n下离心20m i n后取上清㊂同时收集菌液进行S D S-P A G E 和W e s t e r n B l o t检测,收集上清进行荧光发射光检测㊂1.6重组菌株的S D S-P A G E和W e s t e r n B l o t检测重组蛋白通过15%分离胶(供应商:M D B i o,T a i w a n, C h i n a)的S D S-P A G E检测,用C o o m a s s i e B l u e R-250(供应商:S a n g o n B i o t e c h,Q i n g d a o,C h i n a)染色观察㊂W e s t e r n B l o t使用别藻蓝蛋白特异性抗体(供应商:B o s t e r B i o l o g i c a l T e c h n o l o g y C o.L t d.)为一抗(比例为1ʒ1000),H R P标记山羊抗兔I g G(S a n g o n B i o-t e c h,C h i n a)为二抗(比例为1ʒ2000)㊂1.7重组菌株的荧光发射光谱检测利用荧光分光光度计H I T A C H I F-4600进行荧光发射光谱分析㊂狭缝宽度为10.0n m,扫描速度为1200n m/m i n[24]㊂根据最高荧光发射峰反向扫描得到的最高荧光激发峰检查菌株的荧光发射光谱㊂在600n m激发光下检测别藻蓝蛋白A P C的荧光发射光谱,计算单位质量A P C的荧光强度:单位质量A P C的荧光强度=荧光发射峰值/A P C浓度㊂2结果分析2.1基因簇a p c A B同a p c A和a p c B的克隆及序列比对分析2.1.1脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因簇的克隆脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因全长共1056b p,经B l a s t 程序序列比对及D N A M A N软件氨基酸预测可以发现,a p c A B基因由a p c A和a p c B两个基因串联组成,中间间隔了84b p,故又称为a p c A B基因簇,其基因序列及氨基酸序列如图1所示,图1中下划线处为间隔序列㊂为了便于基因表达和功能分析,本研究进一步克隆了脱辅基别藻蓝蛋白单亚基基因a p c A和a p c B㊂图1a p c A B基因簇的核苷酸及氨基酸序列F i g.1 N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d a m i n o a c i d o f a p c A B g e n e c l u s t e r36中国海洋大学学报2023年2.1.2脱辅基别藻蓝蛋白a p c A基因的克隆及序列分析以A.p l a t e n s i s F A C H B314基因组D N A为模板,以a p c A314-F和a p c A314-R为引物扩增得到a p c A 基因,经克隆得到的a p c A基因序列及氨基酸序列如图2所示㊂经本文1.3节所提及的软件分析通知:a p c A 基因全长486b p,G C含量为50.2%;a p c A基因无内含子,共编码161个氨基酸;预测编码蛋白A p c A等电点为4.89,预测分子量约为17.39k D a;A p c A正电荷残基(A s p+G l u)23个,负电荷残基(A r g+L y s)18个,不稳定系数经计算为32.24(<40),表明蛋白是稳定的㊂同保守结构域数据库比对结果如图3所示,A p c A 属于G l o b i n_l i k e超级家族,这种珠蛋白结构域超级家族包含各种各样的全螺旋蛋白,它们结合卟啉㊁藻胆素和其他非血红素辅因子㊂57~126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂如图4所示,它的氨基酸序列在蓝藻中较为保守,相似度为91.84%,同红藻之间的序列相似度为90.68%,包含的保守结构域有T K S I V N A D A E A R Y L S P G E L-D R I K㊁L F Q K R P D㊁G N A Y G㊁E M T A T C L R D㊁D Y Y L-R L㊁T P I E E I G和S L G T P㊂第81位氨基酸在一个保守的半胱氨酸,推测可能是色基结合位点㊂图2a p c A基因的核苷酸及推测的氨基酸序列F i g.2 N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d o f a p c A g e ne图3A.p l a t e n s i s F A C H B314A p c A保守结构域数据库比结果F i g.3 R e s u l t s o f A p c A c o n s e r v e d d o m a i n d a t a b a s e c o m p a r i s o n(图中黑色方框代表保守结构域,所选取的物种为A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b(A E V40861.1)㊁L y n g b y a s p.P C C8106(W P_009787434.1)㊁P l a n k t o t h r i x s p.U B A8402(H A N74958.1)㊁S y n e c h o c o c c u s s p.P C C73109(W P_062434871.1)㊁O s c i l l a t o r i a l e s M T P1(W P_058881332.1)㊁C a l o t h r i x d e s e r t i c a(W P_ 127083433.1)㊁P y r o p i a y e z o e n s i s(p d b|1K N1|A)㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s(M N105086)㊂T h e b l a c k b o x i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v a t i v e d o m a i n,a n d t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b(A E V40861.1),L y n g b y a s p.P C C8106(W P_009787434.1),P l a n k t o t h r i x s p.U B A8402 (H A N74958.1),S y n e c h o c o c c u s s p.P C C73109(W P_062434871.1),O s c i l l a t o r i a l e s M T P1(W P_058881332.1),C a l o t h r i x d e s e r t i c a(W P_ 127083433.1),P y r o p i a y e z o e n s i s(p d b|1K N1|A),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s(M N105086).)图4 A p c A同源序列比对结果F i g.4 T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e a n a l y s i s r e s u l t s o f A p c A4612期毕 莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究图5为钝顶节旋藻(A .pl a t e n s i s F A C H B 314)A pc A 氨基酸序列同其他物种最相近氨基酸序列所作的进化树(自展1000次)㊂结果显示,其A pc A 序列与A .e rd o se n s i s e b (A E V 40861.1)以99%的置信度聚为一支,表明其在钝顶节旋藻中较为保守㊂同大型红藻条斑紫菜(P y r o pi a y e z o e n s i s )(p d b |1K N 1|A )和龙须菜(G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s )(M N 105086)的亲缘关系较远且位于不同分支,表明其序列的相似性同物种的亲缘关系一致㊂(节点处的数字代表可信度㊂组之间的进化距离为0.02㊂所选取的物种为A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b (A E V 40861.1)㊁L y n g b y a s p .P C C 8106(W P _009787434.1)㊁P l a n k t o t h r i x s p .U B A 8402(H A N 74958.1)㊁S yn e -c h o c o c c u s s p.P C C 73109(W P _062434871.1)㊁O s c i l l a t o r i a l e s M T P 1(W P _058881332.1)㊁C a l o t h r i x d e s e r t i c a (W P _127083433.1)㊁P y r o pi a y e z o e n -s i s (p d b |1K N 1|A )㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s (M N 105086)㊂N u m -b e r s r e p r e s e n t e d t h e c r e d i b i l i t y .T h e e v o l u t i o n a r y di s t a n c e b e t w e e n g r o u p s w a s 0.02.T h e t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s pi r a e r d o s e n s i s (E B :A E V 40861.1),L y n g b ya s p .P C C 8106(W P _009787434.1),P l a n k t o t h r i x s p .U B A 8402(H A N 74958.1),S yn e c h o c o c c u s s p .P C C 73109(W P _062434871.1),O s c i l l a t o r i a l e s M T P 1(W P _058881332.1),C a l o t h r i x d e s e r t i c a (W P _127083433.1),P y r o pi a y e z o e n s i s (p d b |1K N 1|A ),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105086).)图5 A pc A 系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f A pc A 2.1.3脱辅基别藻蓝蛋白a pc B 基因的克隆及序列结构分析 以A .p l a t e n s i s F A C H B 314基因组D N A 为模板,以a p c B 314-F 和a pc B 314-R 为引物扩增得到a p c B 基因㊂经克隆得到的a pc B 基因序列及A p c B 氨基酸序列如图6所示㊂a pc B 基因全长486b p ,G C 含量为48.1%,理论等电点为6.25,预测分子量约为17.33k D a ,无内含子,共编码161个氨基酸,正电荷残基(A s p +G l u )16个,负电荷残基(A r g +L ys )16个,不稳定系数经计算为25.81(<40),表明蛋白是稳定的㊂图6 a pc B 基因的核苷酸及推测的氨基酸序列F i g .6 N u c l e o t ide s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d of a pc B g e n e 同保守结构域数据库比对结果如图7所示,A pc B 也属于G l o b i n _l i k e 超级家族㊂如图8所示,A p c B 氨基酸序列较为保守,同蓝藻A pc B 氨基酸序列相似度为94.75%,同红藻A p c B 氨基酸序列相似度为84.47%,第60~126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂包含的保守结构域:Q D A I T ㊁D V Q G K Y L D ㊁T G E L R V R A ㊁A N A A ㊁L L Y S D ㊁T R P G G N M Y T T R -R Y A A C I R D L D Y Y L R Y ㊁M L A G D ㊁S I L D E R V -L N G L K E T Y N S L G V P ㊁Q A I Q A ㊁K E V T ㊁D A G K E M G和S G L S ㊂第81位是一个保守的半胱氨酸,推测可能是色基结合位点㊂图9为钝顶节旋藻(A .pl a t e n s i s F A C H B 314)A pc B 氨基酸序列同其他物种最相近的氨基酸序列所作的进化树(自展1000次)㊂其中所选取的物种及其序列号为A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1),L i m n o r a ph i s r o b u s t a (W P _046276870.1),P l a n k t o -t h r i x t e p i d a (W P _072720267.1),M i c r o c y s t i s a e r u gi -n o s a (W P _149106796.1),N o s t o c (W P _094349822.1),T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1),O s c i l l a t o r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1),G r a c i l a r i o ps i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087).结果显示,其A p c B 序列同A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1)以97%的置信度聚为一支,表明A p c B 序列在钝顶节旋藻中较为保守;其A p c B 序列同G .l e m a n e i fo r m i s (M N 105086)A pc B 序列位于不同分支,表明其同蓝藻亲缘关系较远㊂2.2 别藻蓝蛋白的重组表达为研究从A .pl a t e n s i s F A C H B 314中获得的脱辅56中 国 海 洋 大 学 学 报2023年基别藻蓝蛋白的单亚基是否能在体外同藻蓝胆素结合并组装成具有荧光活性的别藻蓝蛋白,在I P T G 浓度为0.1m m o l /L 下对转化菌株E .c o l i H P E F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 以及空白对照E .c o l i B L 21进行4h的诱导表达(30ħ,200r /m i n)㊂将诱导表达好的菌株制成蛋白样品进行S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 检测㊂图7 A .pl a t e n s i s F A C H B 314A p c B 保守结构域数据库比对的结果F i g .7 A l i g n m e n t r e s u l t s o f A .pl a t e n s i s A p c B F A C H B 314c o n s e r v a t i v e d o m a i n d a t a b a se (图中黑色方框代表保守结构域,所选取的物种为A r t h r o s p i r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1)㊁L i m n o r a ph i s r o b u s t a (W P _046276870.1)㊁P l a n k t o t h r i x t e p i d a (W P _072720267.1)㊁M i c r o c y s t i s a e r u gi n o s a (W P _149106796.1)㊁N o s t o c (W P _094349822.1)㊁T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1)㊁O s c i l l a t o -r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1)㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087)㊂T h e b l a c k b o x i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v a t i v e d o m a i n ,a n d t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s p i r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1),L i m n o r a p h i s r o b u s t a (W P _046276870.1),P l a n k t o t h r i x t e pi d a (W P _072720267.1),M i c r o c y s t i s a e r u gi n o s a (W P _149106796.1),N o s t o c (W P _094349822.1),T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1),O s c i l l a t o r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087).)图8 A pc B 同源序列比对结果F i g .8 T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e a n a l y s i s r e s u l t s o f A pcB (节点处的数字代表置信度㊂组之间的进化距离为0.02㊂N u m b e r s r e -p r e s e n t e d t h e c r e d i b i l i t y .T h e e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e b e t w e e n g r o u ps w a s 0.01.)图9 A pc B 系统进化树F i g .9 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f A pc B S D S -P A G E 结果如图10所示,除空白对照外,重组菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B在大于14k D a 的位置均出现了条带,这同天然脱辅基别藻蓝蛋白单亚基约17k D a 大小相近㊂W e s t e r n B l o t 结果如图11所示,使用别藻蓝蛋白特异性抗体杂交时,除空白对照外,重组表达菌株E .c o l i H P E F U S T A和E .c o l i H P E F U S T B 也均在约17k D a 大小出现了特异性的杂交带㊂S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 结果均证明重组菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E -F U S T B 中有别藻蓝蛋白单亚基的表达㊂6612期毕 莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究(M :标记;B :空白对照E .c o l i B L 21;泳道1㊁2分别为E .c o l i H P E -F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B ㊂箭头所指为重组菌株E .c o l i H P E -F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 出现的条带㊂M :M a r k e r ;B :B l a n k c o n -t r o l E .c o l i B L 21;L a n e 1,2w e r e E .c o l i H P E F U S T A a n d E .c o l iH P E F U S T B ,r e s p e c t i v e l y.T h e a r r o w s i n d i c a t e t h e b a n d s o f E .c o l i H P E F U S T A a n d E .c o l i H P E F U S T B .)图10 重组菌株的S D S -P A G EF i g.10 S D S -P A G E o f r e c o m b i n a n t s t r a i n s 2.3重组表达菌株的荧光发射光谱分析在600n m 波长光激发下,重组表达菌株的荧光发射光谱如图12所示㊂结果显示,除了空白对照外,重组表达菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E -F U S T B 均在约640n m 处有荧光峰,表明重组菌株均合成了具有荧光活性的别藻蓝蛋白㊂其中E .c o l iH P E F U S T B 的单位质量荧光强度为538.27ʃ1.26,E .c o l i H P E F U S T A 的荧光强度(514.01ʃ2.88)相比于E .c o l i H P E F U S T B 的单位质量荧光强度略低(见表2)㊂(M :标记;B :空白对照E .c o l i B L 21;泳道1㊁2分别为E .c o l i H P E -F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B ㊂箭头所指为重组菌株E .c o l i H P E -F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 出现的杂交带㊂M :M a r k e r ;B :B l a n kc o n t r o l E .c o l i B L 21;L a n e 1,2w e r e E .c o l i H P E F U S T A a nd E .c o l iH P E F U S T B ,r e s p e c t i v e l y .T h e a r r o w s i n d i c a t e h yb r i d i z a t i o n b a n d s o f E .c o l i H P E F U S T A a nd E .c o l i H P E F U S T B .)图11 重组菌株的W e s t e r n B l o tF i g.11 W e s t e r n B l o t o f r e c o m b i n a n t s t r a i ns 图12 重组菌株的荧光发射光谱图F i g .12 F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s pe c t r u m of r e c o m b i n a n t s t r a i n s 表2 重组菌株荧光强度和蛋白质含量的定量分析T a b l e 2 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y an d p r o t e i n c o n t e n t i n t h e r e c o m b i n a n t s t r a i n s 重组菌株R e c o m b i n a n t s t r a m总蛋白浓度T o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n /(m g/m L )A p c 占比P e r c e n t a ge of A p c /%A pc 浓度C o n c e n t r a t i o n o f A p c /(m g /m L )荧光强度F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y单位质量荧光强度F l u r e s c e n c e i n t e n s i t y pe r u n i t m a s s 荧光峰F l u o r e s c e n c epe a k /n m E .c o l i H P E F U S T A39.756.42.541362.15ʃ7.32514.01ʃ2.88640.2E .c o l i H P E F U S T B43.036.62.831523.32ʃ3.57538.27ʃ1.26640.4注:结果表示为三次重复标准偏差的平均值㊂T h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d a s t h e m e a n s o f m e a s u r e m e n t s f r o m t h r e e r e pe a t e d s t a n d a r d d e v i a t i o n s .3 讨论自从B r ya n t 等[14]于1985年在大肠杆菌中成功表达出别藻蓝蛋白基因以来,基因工程技术已被用于别藻蓝蛋白的异源表达㊂随后,具有光学活性的重组别藻蓝蛋白在大肠杆菌中成功表达,藻胆素的合成途径76中国海洋大学学报2023年也逐渐被解析出来[25]㊂脱辅基别藻蓝蛋白是生物合成具有光学活性别藻蓝蛋白的基本元件,本实验从A.p l a t e n s i s F A C H B314中克隆得到了编码脱辅基别藻蓝蛋白a p-c A B,经序列比对和D N A M A N软件的预测发现,a p-c A B包含a p c A和a p c B两段编码框,分别编码别藻蓝蛋白α亚基和β亚基㊂天然别藻蓝蛋白由α和β两个亚基组成,两个亚基组合在一起形成单体,再进一步组合,最终以三聚体(αβ)3的形式存在[8]㊂a p c A与a p c B 在基因结构上串联在一起的,这可能更有利于两个基因协同表达,这同钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基和β亚基基因也是串联在一起的情况是一致的㊂a p c A与a p c B 之间存在84b p的基因间隔区,在A.p l a t e n s i s F A C H B314藻蓝蛋白α亚基和β亚基基因之间也存在一段112b p的间隔区[26],基因间隔区可能具有启动子或增强子功能,在调节两个基因表达中发挥作用㊂a p c A和a p c B基因全长均为486b p,共编码161个氨基酸,无内含子,G C含量分别为50.2%和48.1%,预测分子量分别约为17.39和17.33k D a;保守结构域分析显示A pc A和A p c B都属于G l o b i n_l i k e超级家族,系统进化树分析表明它们的氨基酸序列在蓝藻和钝顶节旋藻中较为保守,序列相似度高于其二者在红藻中的相似度㊂有荧光活性的别藻蓝蛋白的产生需要别藻蓝蛋白的α亚基和β亚基半胱氨酸残基分别结合藻蓝胆素[6-7]㊂根据保守结构域分析显示A p c A的57~126位氨基酸,A p c B的60-126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂其中α亚基和β亚基第81位各有一个半胱氨酸,藻蓝胆素是通过半胱氨酸结合到藻胆蛋白亚基上的,因此α亚基和β亚基第81位的半胱氨酸可能为藻蓝胆素的结合位点㊂为了研究脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基是否能在体外同藻蓝胆素结合并组装成具有荧光活性的别藻蓝蛋白,本研究进一步构建了含有脱辅基别藻蓝蛋白单亚基基因的质粒p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F 和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F,同实验室前期构建的含有合成藻蓝胆素相关基因的表达载体p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T共同转化至表达菌株E.c o l i B L21 (D E3)中,构建出能够合成荧光活性别藻蓝蛋白单独亚基的重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A㊁E.c o l i H P E F U S T B㊂经诱导表达后,S D S-P A G E结果显示重组菌株在17k D a左右均有明显的条带,W e s t e r n B l o t 结果显示特异性抗体杂交下重组菌株在特定位置也有明显的杂交条带,说明重组菌株中都有别藻蓝蛋白亚基的合成㊂荧光发射光谱显示,重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A和E.c o l i H P E F U S T B均在约640n m 处有荧光峰,其中E.c o l i H P E F U S T A的单位质量荧光强度为514.01ʃ2.88,E.c o l i H P E F U S T B的单位质量荧光强度为538.27ʃ1.26,这表明重组菌株均合成了具有荧光活性的别藻蓝蛋白㊂但相比于天然别藻蓝蛋白特征荧光峰660n m,出现了20n m的蓝移㊂这一结果同文献[15,27]中的结果类似,重组别藻蓝蛋白h o l o-A p c A S㊁h o l o-A p c A T和h o l o-A p c B T的荧光发射峰分别出现于639㊁638和642n m㊂这可能与本研究中表达的是单一亚基有关,而且可能同体外重组表达造成重组蛋白的构象不同于天然组装蛋白的构象相关㊂此外,有研究表明藻蓝胆素与脱辅基别藻蓝蛋白结合的稳定性也会影响光学性质[28]㊂本研究重组表达了有光学活性的A.p l a t e n s i s F A C H B314别藻蓝蛋白单亚基,为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件㊁别藻蓝蛋白在医药及荧光检测方面的应用奠定了基础㊂参考文献:[1]姜晓杰,高金亮,祁美荣,等.钝顶螺旋藻别藻蓝蛋白α㊁β亚基基因的克隆及其原核表达[J].中国生物制品学杂志,2015,28:356-359.J i a n g X J,G a o J L,Q i M R,e t a l.C l o n i n g a n d p r o k a r y o t i c e x-p r e s s i o n o fαa n dβs u b u n i t s o f a l l o p h y c o c y a n i n f r o m S p i r u l i n a p l a t e n s i s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l s,2015,28:356-359.[2]张学成,信式祥,李清华,等.节旋藻 最完美的功能食品[M].青岛:青岛海洋大学出版社,1999:55-89.Z h a n g X C,X i n X X,L i Q H,e t a l.A r t h r o s p i r a t h e M o s t P e r-f e c t F u n c t i o n a l F o o d[M].Q i ng d a o:Q i n g d a o O c e a n U n i v e r s i t yP r e s s,1999:55-89.[3]林凡,邹立红,秦松,等.抗肿瘤海洋药物-基因重组藻胆蛋白的研制[C]//中国科学院海洋科学青年学术研讨会暨2001年海洋湖沼科学青年学者论坛论文摘要集.青岛:中国科学院海洋研究所,2001:65.L i n F,Z o u L H,Q i n S e t a l.D e v e l o p m e n t o f a n 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藻蓝蛋白的分离与纯化姓名：郭均学院：食品与生物工程班级：食安 09-2学号：200906041069藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。

二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。

此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。

藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。

另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。

利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。

研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。

盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。

最常用脱盐的方法是透析。

蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。

蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm处吸光值成正比。

离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。

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藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。

二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。

此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。

藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。

另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。

利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。

盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。

最常用的脱盐方法是透析。

蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。

蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm 变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm 处吸光值成正比。

离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。

蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。

螺旋藻藻蓝蛋白的分离摘要: 藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中, 具有抗氧化、增强人体免疫力等功能, 又可制成荧光探针, 用于免疫学、细胞生物学等领域。

本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。

藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白, 由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。

藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20% , 是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100% 的高效率把光能优先地传递给光系统。

藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。

同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等, 用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。

同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。

由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景, 在螺旋藻的含量较高, 螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。

1工艺流程弃去下层墨绿色沉淀↗螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘弃去黄绿色上清液2分离纯化具体方法2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。

2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。

如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。

实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。

其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。

肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。

天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。

与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。

分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。

因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。

藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。

一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。

整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。

有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。

1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。

论螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究作者：陈军峰来源：《科学与财富》2018年第14期摘要：螺旋藻藻蓝蛋白是一种具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、保肝等功能的物质，且可用于食品、医疗等领域，具有较高的利用价值，对改善公众健康具有积极的作用。

而螺旋藻藻蓝蛋白在具体的生产中，提取纯化方法是影响螺旋藻藻蓝蛋白产量的重要因素。

故此，文章展开对螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法的分析，结合相关研究内容分别对提取方法和纯化技术进行阐述，旨在为螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化提供参考，推动螺旋藻藻蓝蛋白产量提升。

关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；提取方法；纯化技术螺旋藻为丝状多细胞螺旋形原核藻类生物，具有较高的蛋白含量，且螺旋藻本身具有较好的繁殖能力，可为螺旋藻大范围繁育提供基础。

而螺旋藻藻蓝蛋白则是一种安全，且无毒副作用的蛋白资源，可应用到诸多领域中。

当前，国内外研究者对螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化较多，并取得了一定的成就。

基于此，螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法展开研究与分析，分析具体几种纯化技术，详细内容如下。

1螺旋藻藻蓝蛋白的相关研究1.1螺旋藻藻蓝蛋白结构藻蓝蛋白包含一个蛋白与一个发色团，其中蛋白是由分子量18Mu与20Mu的α和β亚基构成，且二者之间相互作用，使得单体形成，且单体间由多台连接，形成多聚体。

藻蓝蛋白的亚基体内以多聚体形式存在，包含三聚体、六聚体等。

且藻蓝蛋白的聚集态受到PH值、蛋白质浓度等因素影响。

1.2藻蓝蛋白的生理活性藻蓝蛋白是一种安全、无毒的蛋白资源，其具有显著的生理活性特征，先对藻蓝蛋白的生理活性展开分析，详细内容如下。

（1）抗氧化性。

相关研究表明，藻蓝蛋白可清除过氧化亚硝酸阴离子，如ONOO-，且研究中还发现，随着藻蓝蛋白的含量增加，其抗氧化活性也得到明显增加。

说明藻蓝蛋白的具有可清除有毒自由基的功能，且其本身无毒无害，可作为治疗药剂使用。

（2）抗炎性。

研究人员对藻蓝蛋白的抗炎性进行分析，发现藻蓝蛋白对活性氧具有清除行为。