免疫共沉淀与Western Blot
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免疫共沉淀与Western Blot
实验步骤:
1.以60mm细胞培养皿为例,细胞转染后24-36小时后,吸净培养液(可用PBS 小心漂洗一次)。
2.加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。
3.将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内,于冷冻离心机4℃,13000g离心30分钟。
4.将离心后的上清液分为两份:一份35μl,加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟,做为总细胞裂解液(total cell lysate,TCL)于-20℃保存,或取6-10μl进行SDS-PAGE电泳,Western blot检测目的蛋白的表达水平(接第5步)。另一份用于免疫沉淀,具体操作如下:
1)分A/G beads:按每管(一个免疫沉淀样品)加入5μl Agrose A/G beads 及5μl(1μg)抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量,将抗体和beads混合,补充lysis buffer(补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物),将beads及抗体的混合物按每管50μl(含5μl beads及5μl抗体)分配到1.5ml Eppendorf管中,再加入400μl1×lysis buffer,备用;
2)从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步(步骤1))已分好的beads中,使终体积达到850μl,将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转(15rpm)免疫沉淀3小时;
3)将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟,去上清,加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads,于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,共洗涤三次。
4)最后一次洗涤完毕,弃上清,管中只剩Beads,加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合,于100℃煮沸10分钟,稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶,进行电泳,或-20℃冻存。
5.电泳完毕,取下PAGE胶,与PVDF膜做成"三明治"形状,用湿转法进行电转1小时。
6.电转完毕,取下PVDF膜,加入5%脱脂奶粉,于脱色摇床摇荡(75rpm)封闭1小时以消除非特异背景。
7.封闭完毕,用TBST洗掉牛奶,加入一抗,于脱色摇床摇荡孵育(75rpm)1小时,使一抗与特异蛋白结合。
8.回收一抗,用TBST洗3次(75rpm),每次5-10分钟。
9.加入二抗,于脱色摇床孵育1小时,使二抗与一抗结合。
10.用TBST洗3次,每次5-10分钟。
11.将ECL A液和ECLB液各1ml,混匀,放入二抗孵育后的PVDF膜30秒,将PVDF膜平铺于曝光盒中,进暗房,用医学X光胶片曝光。
12.经过显影、定影后的胶片,于室温下自然风干或烘干,描画蛋白marker便于分析。
注:如只做Western Blot,跳过步骤4即可。
实验试剂:
1.PBS:
NaCl20mM,KCL2.68mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.76mM(pH7.4),室温保存。
2.1×lysis buffer:
Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,Triton X-1001%,Sodium pyrophosphate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaVO4 1mM,Leupeptin1ug/ml,-20℃保存。(稀释成1×lysis buffer后加入1mM PMSF)
3.2×SDS sample buffer:
Tris-Cl(pH6.8)125mM,SDS4%,甘油20%,DTT100mM,溴酚兰0.02%,室温保存。
4.分离胶(下层胶)(10%SDS-PAGE)15ml:
30%丙烯酰胺5ml,10×lower buffer(pH8.8)1.5ml,H2O8.5ml,10%AP15μl,TEMED15μl。
5.10×lower buffer(pH8.8)100ml:
42.25g Tris base,10ml10%SDS,室温保存。
6.压缩胶(上层胶)(4%SDS-PAGE)5ml:
30%丙烯酰胺0.65ml,4×stacking buffer(pH6.8)1.25ml,H2O3.05ml,10% AP5μl,TEMED5μl。
7.4×stacking buffer(pH6.8)100ml:
6.06Tris base,4ml10%SDS,室温保存。
8.电泳缓冲液:
Tris base0.125M,甘氨酸0.96mM,SDS0.5%,室温保存。
9.电转缓冲液:
Tris25mM,甘氨酸0.2mM,甲醇10%,室温保存。
10.10×TBS(pH7.6):
Tris base2.42%,NaCl8%,室温保存。
11.TBST:
1×TBS,Tween-200.1%,室温保存。