活性氧及其检测方法

dcfh-da活性氧检测原理DCFH-DA（Dichlorofluorescein Diacetate）是一种常用的细胞活性氧（ROS）检测试剂，常用于测量细胞内ROS的水平。

下面将详细介绍DCFH-DA活性氧检测原理。

活性氧（ROS）是包括超氧阴离子（O2^-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等化学物质的总称，它们在细胞内被不同的酶系统产生，并在一定程度上参与调节细胞的生理功能。

然而，当细胞内ROS的产生量超过细胞应对能力时，ROS会产生一系列不利于细胞健康的效应，如氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等，从而引发多种疾病的发生。

DCFH-DA是一种脂溶性染料，可以通过细胞膜进入细胞内。

一旦进入细胞内，细胞内酯酶会水解DCFH-DA成为非荧光染料DCFH （Dichlorofluorescein）。

DCFH在细胞内没有荧光，但当与ROS接触时，ROS会氧化DCFH成为强荧光荧光素（DCF）。

DCF既可以通过细胞色素c还原成DCFH，也可以通过氧化还原酶系统产生交替的氧化还原反应。

这使得DCF在细胞内荧光物质充分利用细胞内不同环境中ROS含量变化敏感性。

DCFH-DA活性氧检测的原理主要包括两个方面：首先，DCFH-DA通过脂溶性能够迅速进入活细胞，然后在细胞中被酯酶水解为DFCH，DFCH可以被氧化成强荧光的DCF。

然后，DCF可以发射可见光区的绿色荧光，并且荧光的强度和ROS的浓度呈正相关关系。

因此，通过测量DFC发出的荧光信号的强度，可以间接反映细胞内ROS的水平。

在实际的检测过程中，研究人员通常将DFCH加入到细胞培养基中，培养一段时间以使DFCH进入细胞内。

然后，用PBS（磷酸盐缓冲液）彻底地洗涤细胞，以去除细胞外的DFCH。

然后，通过显微镜或流式细胞术等方法观察细胞内的强荧光信号，并定量测量荧光强度。

通过与一系列的标准曲线比较，可以将荧光信号转换为ROS浓度。

综上所述，DCFH-DA活性氧检测利用DFCH的荧光属性实现了细胞内ROS水平的可视化和定量测量。

·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
植物中活性氧的检测方法
祁艳 王冬梅
（ 河 北 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 保 定 ０７１００１）
摘 要： 主要对超氧阴离子自由基（ Ｏ ２－·） 、过氧化氢（ Ｈ２Ｏ ２） 等活性氧的检测方法， 包括化学发光法、分光光度法、荧 光染色法， ＥＰＲ 波谱学方法、ＤＡＢ 组织染色法和电子显微技术检测法等进行了综述， 并简单介绍了最近发展起来的一些新 技术。
１．３ 荧光染色法 运用荧光染色技术可进行活体和离体亚细胞水
平的 Ｈ２Ｏ２ 检测。常用的荧光染料有 ２＇ ， ７＇ －二氯氢化荧 光 素 二 乙 酯 （ ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ， ＤＣＦＨＤＡ） 、 ４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、７－羟－６ 甲 基 香 豆 素 （ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ） 、 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－３， ７－ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ） 及 高 香 草 醛 酸 （ ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ） 等 。在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 ， Ｈ２Ｏ２ 可 氧 化 这 些 物 质 生 成 极 易 检 测 的 发 荧 光 的 物 质 ， 此 法 简 便 有 效 ， 应 用 广 泛 。有 研 究 者 用 荧 光染色法检测了豌豆（ Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ） 叶片衰老过程中 线 粒 体 、过 氧 化 物 酶 体 中 的 Ｈ２Ｏ２［１０］及 萝 卜 （ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ） 种 子 在 萌 发 过 程 中 经 光 照 、ＧＡ、ＡＢＡ 调 控 下 Ｈ２Ｏ２ 的 释 放 ［１１］。 Ｏｒｏｚｃｏ－Ｃａ′ｒｄｅｎａｓ 等 ［１２］曾 用 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ 定 量 检 测 了 番 茄 （ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） 叶 片 提 取 液 中 的 Ｈ２Ｏ２。 本 研 究 室 陈 晓 波 ［１３］以 激 发 子－原 生质体简化实验系统模拟叶锈菌侵染小麦叶片的 互 作 体 系 ， 利 用 荧 光 探 针 ＤＣＨＦＤＡ 标 记 Ｈ２Ｏ２， 并 借 助 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 （ ＣＬＳＭ） 来 研 究 植 物 抗 病 过 程 中 微 丝 骨 架 与 ＲＯＳ 的 关 系 ， 取 得 了 良 好 效 果 ； 笔者用该法成功检测了受叶锈菌侵染的小麦叶片 中 ＲＯＳ 的 变 化 （ 待 发 表 ） 。

活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。

而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。

检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。

Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。

二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。

⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。

⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。

⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。

洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。

⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。

⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。

⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。

三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3、荧光检测： ①、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测；
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。