活性氧检测试验方案

过氧化苯甲酰BPO活性氧含量测定1方法提要试样溶解于二氯甲烷和冰乙酸的混合溶液中,加入饱和碘化钾溶液,有机过氧化物与碘化钾溶液作用,生成碘,碘与定量的硫代硫酸钠标准溶液作用,重新被还原,根据消耗的硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积,计算得到有机过氧化物的含量。

2适用范围碘化钾-室温检测方法适用的有机过氧化物包括:a) 二酰基过氧化物:过氧化苯甲酰、过氧化双-(2,4-二氯苯甲酰)、过氧化对氯苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化乙酰、过氧化葵酰;b) 二元酸过氧化物:过氧化丁二酸;c) 酮类过氧化物:过氧化环己酮、过氧化甲乙酮;3 仪器3.1 碘量瓶:250mL。

3.2 滴定管:50mL,最小刻度0.1mL。

3.3 分析天平:感量0.0001g。

4 试剂和材料4.1 冰乙酸。

4.2 二氯甲烷。

4.3 氮气,纯度不低于99.99%。

4.4 饱和碘化钾溶液:在脱氧水中制备碘化钾的饱和溶液。

该溶液应当在使用前的现场配制,并且制备后应将它存放在棕色玻璃瓶中。

4.5 硫代硫酸钠标准滴定溶液:c(Na2S2O3)=0.1mol/L。

4.6 淀粉指示液:50g/L。

4.7 脱氧水:在使用前,用氮气通入水中鼓泡5min。

5 分析步骤5.1 量取20mL冰乙酸注入250mL的碘量瓶中,快速通入氮气置换2min,塞紧瓶塞。

5.2 称量含有3mmol~4mmol的活性氧的试样(对于液态挥发性有机过氧化物,称量前可以预先用冰乙酸将试样稀释到一定的体积),精确至0.0001g,加入碘量瓶中。

分析中所用试样的大致重量可通过公式3.5M/(2N×1000)计算。

其中,M 为有机过氧化物的相对分子质量,N 为分子中过氧基团的数量。

5.3 加入10mL二氯甲烷,重新塞好瓶塞,振荡使试样完全溶解或分散。

5.4 加入新鲜配制的饱和碘化钾溶液5 mL,再塞好瓶塞,摇匀后在室温下放置于暗处避光静置15min。

5.5 加入50mL脱氧水,用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定到溶液变成浅黄色,然后再加入1mL~2mL淀粉指示液,继续滴定到无色为终点,记录滴定所耗体积。

DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。

DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。

在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。

DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。

DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。

原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。

因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。

DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。

DCFH-DA检测法的步骤如下：1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。

2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。

DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。

3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。

洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。

4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、辐射、药物等。

较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度的H2O2中一段时间。

5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细胞沉淀。

用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。

6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。

DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等特点。

活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。

而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。

检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。

Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。

二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。

⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。

⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。

⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。

洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。

⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。

⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。

⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。

三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。

活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。

活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。

活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。

常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。

下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。

2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。

3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。

将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。

4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。

5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。

去除上清液，避免细胞牵涉。

6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。

7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。

在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。

活性氧：活性氧(reactive oxygen species , ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2 %的氧生成的，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等。

ROS 的产生主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。

基本信息：氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体, 人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中, 就会感到憋气的痛苦甚至死亡。

所以, 自从1770 年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来, 氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。

可是, 科学技术迅速发展起来的今天, 我们知道, 不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性, 与一般的金属铁一样, 处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈” , 当然这种腐蚀与铁不同, 它体现在人体的细胞水平上。

特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。

1969 年McCord 与Fridovich 发现, 在生化反应过程中O2 获得一个电子还原生成超氧自由基(O-2 ), 进而经过红血球的分离精制后获得O-2 的清除灭活酶, 并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。

这一发现激发了大批的科学研究者致力于O-2 的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理学上的意义。

同时由O-2 衍生出来的过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,O2)也受到了人们的重视。

所谓的活性氧, 概括地说, 是指机体内或者自然环境中由氧组成, 含氧并且性质活泼的物质的总称:主要有一种激发态的氧分子, 即一重态氧分子或称单线态氧分子(O2);3 种含氧的自由基, 即超氧阴离子自由基(O-2 )、羟自由基(·OH)和氢过氧自由基(HO2);2 种过氧化物, 即过氧化氢(H2O2)和过氧化脂质(ROOH)以及一种含氮的氧化物(NO)等。

活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。

ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。

然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。

为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。

以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。

b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。

2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。

b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。

3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。

b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。

c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。

总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。

这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。