过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法

小鼠过氧化氢酶（CAT）ELISA检测试剂盒使用说明书小鼠过氧化氢酶（CAT）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被过氧化氢酶（CAT）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。

颜色的深浅和样品中的过氧化氢酶（CAT）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。

试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。

严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。

全部液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、5、10、20、40、80U/ml 试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法一、目的与要求过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

二、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

过氧化氢在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦或其它叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2.紫外分光光度计；3. 离心机；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。

（三）试剂：1. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/LNaH2P048.5 ml）；2．0.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)二、实验步骤：1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。

2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。

25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。

3、结果计算以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（μ）。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号过氧化氢酶检测试剂盒产品编号 产品名称包装 S0051过氧化氢酶检测试剂盒100次产品简介：过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶(Catalase)活性的试剂盒。

在过氧化氢相对比较充足的情况下，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。

残余的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p- benzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm 。

用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。

过氧化氢酶分布非常广泛。

在肝脏、肾脏和红细胞中，过氧化氢酶的水平非常高，是清除能导致氧化损伤的过氧化氢的主要场所。

过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A 240，但蛋白质或其它组份在A 240附近都有比较强的吸收，会对测定产生严重干扰。

因此，用紫外法测定过氧化氢酶的活性，比较适合纯化的过氧化氢酶。

本试剂盒通过检测A 520来测定过氧化物酶催化下由过氧化氢氧化生色底物产生的红色产物，受干扰的因素小，检测灵敏度高，可以检测出低达1U/ml 的过氧化氢酶。

本试剂盒可以检测全血、红细胞裂解产物、血清、组织匀浆产物、细胞裂解产物等生物样品中的过氧化氢酶的活性。

一个试剂盒共可以进行100次检测。

包装清单：产品编号 产品名称包装 S0051-1 过氧化氢酶检测缓冲液 60ml S0051-2 过氧化氢 (约1M) 5ml S0051-3 过氧化氢酶反应终止液50ml S0051-4 显色底物 20ml S0051-5 过氧化物酶 20µl —说明书1份保存条件：-20ºC 保存，一年有效。

过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。

在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。

三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书一、测定原理：过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。

试剂一(ml)二、试剂组成与配制：试剂一：液体100 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂二：底物液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。

加双蒸水至100 ml溶解，4℃保存1个月。

（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四：液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。

三、组织样本的检测1、组织匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测(最佳取样浓度摸索减附录)。

2、操作表：混匀，波长405nm ，光径0.5cm ，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

注：一般样本没有高脂等导致显著差异情况，对照管的样本更换成双蒸水，做1-2管对照即可。

如需做样本自身对照，则试剂盒所测定样本数量减至48样。

3.组织中CAT 活力的计算：（1）定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1umol 的H2O2的量为一个活力单位。

（2）计算公式： )ml /mgprot (601271)OD -OD ()mgprot /U (CAT *待测样本蛋白浓度取样量值测定值对照活力组织匀浆中÷⨯⨯⨯=注：*271为斜率的倒数 （3）计算举例：取10%水稻叶片匀浆0.05ml 做CAT 检测，测得对照管吸光度为0.605，测定管吸光度为0.332，同时测得10%水稻叶片匀浆蛋白浓度为3.1303 mgprot/ml 。

则计算结果为：()/mgprotU 7351.101303.305.0601271332.0704.0)mgprot /U (CAT =÷⨯⨯⨯-=活力组织匀浆中注：1.测定血清和血浆时，如果样本不溶血，每批样本只需要随机挑2个样本做对照或者用双蒸水代替额样本做对照；如果样本溶血的话，必须每个样本都要做对照。

土壤过氧化氢酶测定试剂盒使用说明分光光度法50管/24样货号:BC0100产品简介：S-CAT 是土壤微生物代谢的重要酶类，在H 2O 2清除系统中具有重要作用。

H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下吸光度的变化，即可反应S-CAT 活性的高低。

试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：试剂一：液体×5瓶，4℃保存；临用前每瓶加入9.9mL 蒸馏水充分溶解后待用。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入2mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

操作步骤：试剂名称测定管无基质管无土管风干土样（g ）0.10.1试剂一（μL ）10001000双蒸水（μL ）1000振荡培养20min试剂二（μL ）252525混匀8000g ，常温离心5min ，取全部上清试剂三（μL ）120120120混匀，用蒸馏水调零，240nm 处记录各管A 值。

注意：每个测定管要设一个无基质管，无土管只要做一管。

S-CAT 活力的计算：单位的定义：每天每g 风干土样催化1μmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。

计算公式：S-CAT（U/g）＝[(A 无土管-A 测定管+A 无基质管)×V 反总÷（ε×d）×106]÷W÷T=18.9×（A 无土管-A 测定管+A 无基质管）V 反总：反应体系总体积，1.145×10-3L；ε：过氧化氢摩尔消光系数，4.36×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，20min=1/72d；W：样本质量，0.1g。

CAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种常见的酶，广泛存在于细胞质和线粒体中，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。

CAT活性的测定是评价细胞氧化应激和抗氧化能力的重要方法之一、本文将介绍两种常用的CAT活性测定方法：碘化钾法和比色法。

1.碘化钾法：碘化钾法是利用过氧化氢在碱性条件下与碘离子反应生成氧气，然后通过滴定测定碘化钾的消耗量，间接测定CAT活性。

实验步骤如下：1）制备适量的超纯水溶解适量的碘化钾，并与浓度为0.1M的Na2CO3缓冲溶液混合，调整pH至10-112）将待测样品加入上述溶液中，使得总体积约为2mL。

3）在和样品相同条件下作空白对照实验。

4）加入10%的H2O2溶液激活酶，使得最后的浓度约为0.1%。

5）停止反应，一般方法是加入0.1M的硫酸停止酶促反应，使得酶催化生成的氧气转化为水。

6）滴定反应液中的I2溶液，直至反应液呈深蓝色为止。

7）计算CAT活性，根据滴定的I2溶液量计算反应液中过氧化氢含量，再用过氧化氢摩尔浓度除以单位时间，得到CAT的活性。

2.比色法：比色法是通过测量酶催化H2O2分解时产生的物质的吸光度或荧光强度变化来间接测定CAT活性。

实验步骤如下：1）将待测样品加入适量的酶活化缓冲液中。

2）加入适量的过氧化氢（一般浓度为10mM）。

3）在和样品相同条件下作空白对照实验。

4）置于适当的反应温度下孵育一段时间。

5）停止反应，一般方法是加入NaOH溶液，将反应液pH调至碱性，停止酶促反应。

6）测定反应液中的吸光度或荧光强度。

7）根据标准曲线计算CAT活性，通过反应液的吸光度/荧光强度与CAT活性的关系曲线，计算待测样品中CAT的活性。

总结：CAT活性的测定方法主要有碘化钾法和比色法，两种方法均是通过间接测定过氧化氢酶催化反应产物氧气的生成量来计算CAT活性。

碘化钾法利用滴定I2溶液的消耗量计算CAT活性，而比色法则通过测定酶催化反应产物的吸光度或荧光强度来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

酵母过氧化氢酶（CAT）的测定方法一、CAT提取1.准备材料、仪器及试剂材料：酵母：5g仪器：天平、电子天平研钵（1个），石英砂，玻璃匀浆器冰箱（1台）玻璃棒（1个）高速离心机离心管容量瓶(1000ml、100ml)量筒SephadexG-75柱试剂：Na2HPO4、NaH2PO4 (0.1M磷酸缓冲溶液（PBS）：PH=7.0 ，20ml)、 (NH4)2SO41.1 0.1M PBS配制母液的配制配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS），根据需要可配制不同浓度PBS。

0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml水；0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水（3）0.2mol/L pH5.7～8.0的PBS的配制如下：取n ml0.2mol/L的NaH2PO4和mml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PBS.0.1MPBS配制0.1M PBS（PH=7.0）：取500ml0.2M PBS{38ml 0.2M NaH2PO4（ml）+62 ml 0.2M Na2HPO4（ml）}，加水稀释至1000ml即可。

2.CAT提取称取干酵母5g→研磨→加20 mL 0.1 mol/L (pH7.0 )磷酸盐缓冲液(PBS)→4℃下放置30 min→玻璃匀浆器研磨20 min(使酵母细胞充分破壁，释放出酶) →10000r/min(4℃)离心15 min→取上清液作为粗酶液(用于测定CAT活性，并用于进一步纯化)3.CAT的提纯以上的粗酶上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到70%→4℃静置15 min→4℃用14 000 r/min离心15 min→取上清液→测定CAT活性→上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到80% → 4℃静置15 min →14 000 r/min离心15 min→取沉淀→沉淀用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH7.0)溶解→测定CAT活性。

过氧化氢酶活性过氧化氢酶（Catalase, CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化植物体内积累的过氧化氢（H2O2）分解为水和分子氧，从而减少H2O2对果蔬组织可能造成的氧化伤害。

在CAT催化H2O2分解为水和分子氧的过程中，该酶起电子传递作用，而过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。

酶2H2O2 →2H2O + O2因此，可根据反应过程中过氧化氢的消耗量来测定该酶的活性。

过氧化氢在波长240 nm处除具有吸收峰，利用紫外分光光度计可以检测过氧化氢含量的变化。

三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、番茄等。

（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、计时器、移液器、离心管、容量瓶（100 mL、1 000 mL）。

（三）试剂1．100 mmol/L、pH 7.5磷酸缓冲液母液A（200 mmol/L Na2HPO4溶液）：称取35.61 gNa2HPO4·2H2O或53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.64 gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。

母液B（200 mmol/L NaH2PO4溶液）：称取27.6 gNaH2PO4·H2O或31.2 g NaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。

取84.0 mL母液A和16.0 mL母液B混合后，调节pH至7.5，然后稀释至200 mL。

2．提取缓冲液（含5 mmol/L DTT和5% PVP）称取77 mg DTT，5 g PVP，用100 mmol/L、pH 7.5磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL，即得提取缓冲液，低温（4℃）贮藏备用。

2．20 mmol/L H2O2吸取227 µL的30% H2O2，用50 mmol/L、pH 7.5的磷酸缓冲液稀释至100 mL，现用现配，低温避光保存。

四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液，低温保存备用。

过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)简介：Leagene 过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)其检测原理是血清或血浆等样品H 2O 2在240nm 处有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过H 2O 2，使待测溶液吸光度随反应时间而减少，通过紫外分光光度计检测240nm 处吸光度，根据测定吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

紫外法又称紫外分光光度计发或紫外吸收法，该酶的检测对于研究植物代谢强度及抗旱、抗病能力有一定的价值。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、 配制CAT Assay buffer 工作液：按 CAT Assay buffer(2.5×)：蒸馏水=1.5：1的比例稀释，即获得CAT Assay buffer 工作液，4℃预冷，待用。

2、 配制100mM H 2O 2基液：本试剂盒提供的H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为1M 。

由于过氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。

把浓度约为1M 的H 2O 2基液用CAT Assay buffer 工作液稀释100倍，使H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为10mM 。

3、 准备样品：①_x0001_细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用LeageneWestern 及IP 细胞裂解液。

如为植物样品或动物组织样品可按下列步骤操作。

a 、取植物样品0.4-0.5g 或动物组织样品，加入预冷的CAT Assay buffer 工作液2ml ，研磨匀浆，转移至15ml 离心管。

再用CAT Assay buffer 工作液冲洗研磨器，合并冲洗液至该离心管，补加CAT Assay buffer 工作液至10ml 刻度。

b 、混匀，4℃冰箱中静置10min ，转移离心管上部的清液至新的离心管中， c 、4500g 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶提取液。

过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒说明书（货号：G0105F分光法48样）一、产品简介：过氧化氢酶(CAT，EC1.11.1.6)普遍存在于植物动物组织中，其活性与生物体的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系。

本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法，即CAT催化过氧化氢产生水与氧气，剩余的过氧化氢与一种新型显色探针显色，其在510nm处有最大吸收峰。

通过过氧化氢的减少量来计算样本中CAT酶的活力。

本试剂盒突出特点是从紫外波长（240nm：过氧化氢的检测波长）转换到可见波长（510nm）检测，无需使用石英比色皿或UV板。

而且由于过氧化氢极其不稳定，直接检测造成读值不稳定，且蛋白质等组分在此紫外波长下也有光吸收，影响结果精确性。

二、试剂盒组分与配制：试剂名称规格保存要求备注提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体60mL×1瓶4℃保存试剂二液体×1支4℃保存用前甩几下使试剂落入底部，取80μL至新EP管中，再加1.56mL蒸馏水混匀备用。

试剂三液体8mL×1瓶4℃保存试剂四液体15mL×1瓶4℃保存标准品液体1mL×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂三、所需的仪器和用品：分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵。

四、过氧化氢酶（CAT）活性测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g组织（水分充足的样本可取0.5g），加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。

4℃×12000rpm离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法一、仪器与用具紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴；二、试剂L 磷酸缓冲液L H 2O 2（用L 高锰酸钾标定）。

[L H 2O 2：市售30%H 2O 2大约等于L ，取30%H 2O 2溶液，稀释至1000ml ，用标准L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；L 高锰酸钾标准液称：取KMnO 4（AR ），用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用L 草酸溶液标定；L 草酸：称取优级纯 ，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。

]三、步骤1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml 离心管中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液。

置5℃冰箱中静置10min ，在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

5℃下保存备用。

2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H 2O 2样品液配置表25℃预热后,逐管加入 L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

四、结果计算：以1min 内A 240减少的酶量为1个酶活单位（u ）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中∆A240 = A S0－() A AS S122+A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；—A240每下降为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H 2O 2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A 240)随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平 【试剂】1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H 2O 2溶液：30% H 2O 2 11.36ml 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml 。

3.0.05 mol/LTris-Hcl 缓冲液（pH7.0） 【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织 【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g 置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml 。

取提取液5ml 于离心管中，在4℃、15000g 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

4℃下保存备用。

2.CAT 活性测定（1）取10ml 具塞试管，加2ml 酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。

（2）取10ml 具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：将上述4支试管于25℃水浴中预热3min 后,逐管加入0.2ml 0.2mol/L 的H 2O 2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s 读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。

（需用石英比色杯） 3.结果计算：以1min 内A 240降低0.1（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u ），先求出3支测定管各自1min 内A 240降低值，按下式计算CAT 活性。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值；( +As 3) A A S S 1 23+Vt—酶提取液总体积（ml）；V1—测定时用酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

过氧化氢酶（CAT）试剂盒说明书一、测定原理：过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。

试剂一（ml）二、试剂组成与配制：试剂一：液体100 ml X1瓶，4C保存6个月。

试剂二：底物液体10 ml XI瓶，4 C保存6个月。

试剂三：显色粉剂X1瓶，4C保存6个月。

加双蒸水至100 ml溶解，4C保存1个月。

（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四：液体10 ml X瓶，4C保存6个月。

天冷时会凝固，临用前37C水浴至透明方可使用。

三、组织样本的检测1、组织匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量（g）:体积（ml）=1 : 9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测（最佳取样浓度摸索减附录）。

2、操作表：混匀，波长405nm ,光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

1 / 2可。

如需做样本自身对照，则试剂盒所测定样本数量减至 48样。

2 / 2注：一般样本没有高脂等导致显著差异情况，对照管的样本更换成双蒸水，做 1-2管对照即3•组织中CAT 活力的计算：（1）定义：每毫克组织蛋白每秒种分解 lumol 的H2O2的量为一个活力单位。

（2）计算公式: 组织匀浆中吿1CAT 活力（U/mgprot ）=（对照OD 值-测定OD 值）271 待测样本蛋白浓度（mgprot/ml ）60 x 取样量注：*271为斜率的倒数 （3）计算举例：取10%水稻叶片匀浆0.05ml 做CAT 检测，测得对照管吸光度为 0.605,测定管吸光度为0.332, 同时测得10%水稻叶片匀浆蛋白浓度为3.1303 mgprot/ml 。

则计算结果为：1组织匀浆中 CAT 活力（U/mgprot ） N 0.704 -0.3322713.1303 =10.7351U/mgprot60 7.05注：1.测定血清和血浆时，如果样本不溶血，每批样本只需要随机挑2个样本做对照或者用双蒸水代替额样本做对照；如果样本溶血的话，必须每个样本都要做对照。