下载文档原格式
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
核酸pcr操作流程
核酸PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技朧，广泛应用于分子生物学、医学诊断、法医学等领域。
下面将介绍核
酸PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
通常包括DNA模板、引物（primer）、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
DNA模板是待扩
增的DNA片段，引物是用于引导DNA合成的短链DNA片段，dNTPs
提供DNA合成所需的四种碱基，聚合酶是催化DNA合成的酶，缓冲
液用于维持反应的pH值。
其次，进行PCR反应。
将PCR反应体系加入PCR管中，放入
PCR仪中进行反应。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将反应体系加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋
成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至50-65摄氏度，引
物与DNA模板结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至72摄氏度，聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶
电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可
以将PCR产物按照大小分离成不同的条带，从而确定PCR反应是否
成功。
实时荧光定量PCR可以实时监测PCR反应的进程，得到更加
准确的结果。
总的来说，核酸PCR是一种快速、灵敏、特异的DNA扩增技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握核酸PCR的操作流程对于
科研人员和临床医生来说至关重要，可以帮助他们更好地进行实验
和诊断工作。
核酸试剂操作方法核酸试剂是用于提取、纯化和测定核酸分子的化学试剂。
核酸试剂的操作方法可以大致分为以下几个步骤：样品处理、溶解、纯化、测定等。
下面我将详细介绍每个步骤的操作方法。
1. 样品处理：在进行核酸提取前，首先需要对样品进行处理。
根据实验的目的和样品的性质，可以选择不同的样品处理方法。
比较常见的样品处理方法包括：细胞裂解、血浆或血清的凝固、骨髓抽提等。
在样品处理过程中要注意采用无菌操作，避免污染。
2. 溶解：将处理后的样品或沉淀加入适当的溶解液中，使核酸完全溶解。
常用的核酸溶解液包括：TE缓冲液、含EDTA的去离子水等。
在样品溶解时，需轻轻摇晃或轻轻慢搅拌，避免生成气泡。
3. 核酸纯化：核酸溶解后，需要进行纯化以去除与核酸有关的杂质，如蛋白质、盐类和酶等。
常用的核酸纯化方法有酚-氯仿法、硅胶柱法、离心柱法等。
不同的纯化方法适用于不同的样品类型和实验需求。
在纯化过程中，需要根据试剂的使用说明进行操作，以保证纯化效果。
4. 核酸测定：核酸纯化后，可以通过一系列测定手段来确定核酸的浓度和纯度。
测定核酸浓度和纯度的方法有：比色法、荧光法、紫外吸收法等。
在进行核酸测定时，需要根据试剂的使用说明和仪器的操作步骤进行操作，确保结果的准确性。
除了上述操作步骤外，核酸试剂的操作还需要注意以下几点：1. 实验室条件：进行核酸实验需要在洁净、无菌的实验环境下进行，避免外源性DNA和RNA的污染。
2. 消毒处理：实验前需要将操作台面、试剂瓶盖、离心管等实验器材进行消毒处理，以避免细菌、病毒的污染。
3. 无菌操作：在进行核酸提取和纯化操作时，需采用无菌技术，包括用纯化的试剂和器皿、带手套、使用滤芯枪头等。
4. 试剂保存：核酸试剂的保存条件需根据试剂的要求进行，常见的存储条件包括-20保存、避光保存等。
5. 操作技巧：在进行核酸试剂操作时，需熟悉试剂的用途和使用方法，并掌握相关实验技巧，以保证试剂的有效使用。
总之，核酸试剂的操作方法涉及样品处理、溶解、纯化和测定等步骤。
新冠核酸检验操作规程新冠核酸检验是一种常用的方法来检测新型冠状病毒感染，以下是新冠核酸检验的操作规程。
一、实验室准备工作：1. 确保实验室内有足够的试剂和耗材，包括核酸提取试剂、PCR试剂盒、纯化试剂盒、标本采集和保存耗材等；2. 检查实验室内的设备完好，并及时进行维护和校准；3. 准备好标本接收和处理的工作区域，并保持清洁和消毒。
二、标本采集和处理：1. 选择适当的采集方法和采集器具，如采用鼻咽拭子或喉拭子；2. 采集标本时，确保操作人员戴好一次性手套、口罩和护目镜，并遵循相关的操作规范；3. 将采集的标本放入含有病毒保存液的标本管中，并确保标本管密封良好；4. 标本采集完毕后，及时送至实验室进行处理。
三、核酸提取：1. 根据核酸提取试剂盒的使用说明，准备好提取试剂和相关的试剂盒；2. 根据提取试剂盒的操作规程，将采集的标本转移到提取试剂中，并进行充分混合；3. 按照试剂盒的说明，采用相应的方法进行病毒核酸的提取；4. 注意防止交叉污染和保持操作区域的清洁；5. 提取完成后，将提取得到的核酸样品保存在低温条件下，以备后续的PCR扩增。
四、 PCR扩增：1. 准备好PCR试剂盒和PCR扩增仪，并根据试剂盒的操作说明进行配置；2. 将核酸样品与PCR试剂混合，并进行扩增反应；3. 注意控制扩增反应的条件和时间，以保证扩增效果和准确性；4. 控制反应体系的污染，避免假阳性结果的发生；5. 扩增反应结束后，将反应产物进行凝胶电泳和解读结果。
五、结果分析和报告：1. 根据PCR扩增结果，分析是否存在病毒核酸的阳性；2. 结果分析应根据相关的操作规范和标准进行，确保结果的准确性；3. 对于阳性结果，应及时向相关部门进行报告，并根据相关的防控指南进行流行病学调查和隔离治疗等工作；4. 对于阴性结果，应综合考虑临床表现、流行病学史等因素，综合判断患者是否可能存在感染。
六、实验室安全和质量控制：1. 实验室操作人员应遵守相关的安全规范和操作规程，确保自身和他人的人身安全；2. 实验室应建立和维护质量控制体系，包括正控和负控样品的使用和管理；3. 定期参加质量评估和技术培训，提高实验室的技术水平和质量控制能力；4. 定期对实验室进行清洁和消毒，以保持实验室的清洁和无菌环境。
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸检测的操作规程核酸检测的操作规程一、实验室准备1. 确保实验室设备正常运行并处于良好状态，包括核酸提取仪、PCR仪、离心机等。
2. 准备所需试剂和材料，包括核酸提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 检查并清洁实验台面及仪器表面，以确保无任何污染。
4. 佩戴防护装备，包括实验帽、实验服、手套等，以防止实验过程中的交叉污染。
5. 核对每个样本的信息，确保准确无误。
二、核酸提取1. 提取样本之前，将样本转移到符合规定的安全实验室。
2. 根据试剂和设备的说明书，进行核酸提取。
将样本加入提取试剂中，充分混合。
3. 使用离心机进行离心分离，离心条件按照试剂盒的要求。
4. 将提取的核酸样品转移至干燥的离心管中，保存在低温条件下，避免冻融。
三、逆转录1. 准备逆转录反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将核酸样品与逆转录反应液混合，反应温度和时间按照试剂盒要求进行设置。
3. 使用逆转录仪进行反应，注意反应过程中温度的稳定。
4. 反应结束后，检查反应液的外观，确保反应成功。
四、PCR扩增1. 准备PCR反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将逆转录反应液与PCR反应液混合，充分混合。
3. 设定PCR仪的温度曲线和扩增时间，确保参数设置正确。
4. 在PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测，检查扩增产物的数量和大小。
五、结果分析和记录1. 根据凝胶电泳的结果，判定扩增产物是否存在。
2. 根据扩增产物的大小和带电泳率，判断所检测的目标基因是否存在。
3. 记录检测结果，包括样本编号、核酸提取情况、逆转录情况、PCR扩增结果等。
4. 输送结果至指定的部门或仪器进行最终结果分析和报告生成。
六、实验后处理1. 清洗实验台面和仪器设备，以确保无任何污染。
2. 妥善处理实验过程中产生的废液和废弃物，按照规定的程序进行处理。
3. 对实验室设备进行常规的维护和保养，以确保正常运行。
以上是核酸检测的操作规程，通过严格的操作流程和规范的实验室操作，可以确保核酸检测的准确性和可靠性，提供有效的数据支持。
核酸检测操作培训课件核酸检测操作培训课件随着新冠疫情的爆发和蔓延，核酸检测成为了目前最主要的病毒检测手段之一。
为了提高核酸检测的准确性和效率，许多机构和实验室都开展了相关的操作培训课程。
本文将介绍一些核酸检测操作培训课件的内容和要点。
一、核酸检测的原理和意义在介绍具体的操作步骤之前，首先需要了解核酸检测的原理和意义。
核酸检测通过提取样本中的核酸，利用特定的引物和酶的作用，扩增目标病毒的核酸片段，并通过荧光信号等方式进行检测和定量。
核酸检测的意义在于及时发现感染者，采取相应的隔离和治疗措施，有效遏制病毒的传播。
二、核酸检测的操作步骤1. 样本采集与保存核酸检测的第一步是样本采集与保存。
常见的样本包括鼻咽拭子、咽拭子、唾液等。
在采集样本时，需要注意采集器具的清洁和消毒，避免外界污染。
采集后的样本应妥善保存，避免温度过高或过低，影响核酸的稳定性。
2. 样本处理与核酸提取样本处理与核酸提取是核酸检测的关键步骤之一。
首先需要将采集的样本转移到提取管中，加入相应的提取缓冲液，破坏细胞膜和核酸的结构。
然后通过离心等操作，将核酸从其他组分中分离出来，并将其溶解在适当的缓冲液中，以便后续的扩增和检测。
3. 核酸扩增与检测核酸扩增与检测是核酸检测的核心步骤。
常用的扩增方法包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
在扩增过程中，需要添加特定的引物和酶，以选择性地扩增目标病毒的核酸片段。
扩增后的产物可以通过荧光信号等方式进行检测和定量。
三、操作注意事项和常见问题在进行核酸检测操作时，需要注意以下几个方面的问题：1. 严格遵守操作规程和实验室安全规定，确保自身和他人的安全。
2. 保持操作环境的洁净和无菌，避免外界污染对实验结果的影响。
3. 使用高质量的试剂和耗材，确保实验的准确性和可靠性。
4. 注意样本的保存和处理方法，避免核酸的降解和损伤。
5. 定期进行设备的维护和校准，确保设备的正常运行和结果的准确性。
核酸检验操作规程核酸检验是一种常见的分子生物学技术，用于检测细胞或体液中的特定基因序列。
在实验室中进行核酸检验时，需要遵守一系列操作规程来确保实验的准确性和安全性。
以下是一个大致的核酸检验操作规程，供参考。
1. 实验室准备- 准备必要的实验器材，如离心机、PCR仪、电泳仪等。
- 检查实验室设备的工作状态和安全性，确保设备正常运转，并符合相关安全标准。
- 准备所需试剂和材料的清单，确保一切准备就绪。
2. 样本处理- 根据实验目的选择相应的样本类型，如血液、组织或细胞。
- 确保样本采集的操作无菌，并在采集后及时储存或运送样本到实验室。
- 样本到达实验室后，及时登记记录样本信息，包括样本编号、来源、保存条件等。
3. 样本提取- 根据不同样本类型选择相应的提取方法，如血液基因提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒等。
- 严格按照提取试剂盒的使用说明进行操作，确保样本的完整性和提取效果。
- 在提取过程中，注意避免污染，使用一次性试剂和消毒工具，避免交叉污染。
4. PCR扩增- 根据实验要求设计或选择适当的引物，确保扩增目标序列的特异性和灵敏度。
- 准备PCR反应液，按照所用试剂盒的使用说明进行操作，确保试剂能够充分反应。
- 设置PCR仪的反应程序和温度条件，包括预变性、循环数和延伸温度等。
- 将样本DNA加入PCR反应管中，注意避免交叉感染，使用无菌操作和正常的实验室防护措施。
5. PCR产物分析- 完成PCR扩增后，将反应产物进行凝胶电泳或其他分析技术的分析。
- 按照分析的需要，准备相应的试剂和试剂盒，如凝胶电泳试剂盒、DNA分子量标记等。
- 按照试剂盒的使用说明，进行凝胶电泳分析，记录并分析结果，评估实验的准确性和可重复性。
6. 结果解读- 考虑实验的条件和方法的特异性，对实验结果进行解读和判断。
- 将实验结果与对照组、负对照和阳性对照进行比较，确保结果的可靠性和准确性。
- 结合临床病史和其他检测结果，给出综合的结果解释和诊断建议。
核酸提取与纯化1. 引言核酸提取与纯化技术是分子生物学研究中的一项基本操作。
随着分子生物学研究的深入，核酸提取与纯化技术变得越来越重要。
通过提取和纯化核酸，可以从生物样本中分离出DNA和RNA，并用于后续的实验分析，如PCR、测序、基因克隆等。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项，以帮助读者更好地理解和应用这一技术。
2. 核酸提取与纯化的基本原理核酸提取与纯化的基本原理是利用不同物质间的化学和物理性质的差异实现核酸的分离和纯化。
一般情况下，核酸提取与纯化的基本步骤包括细胞破碎、核酸溶解、核酸分离、纯化和沉淀。
下面将逐步介绍每个步骤的原理。
2.1 细胞破碎细胞破碎是核酸提取与纯化的第一步，目的是将细胞破坏，释放出细胞内的核酸。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解。
机械破碎是通过物理力量（如搅拌、振荡、高压等）破坏细胞结构，使细胞内的核酸释放。
化学破碎则是利用化学物质（如酸、碱、溶剂等）破坏细胞膜和核酸结构，使核酸溶解。
酶解则是利用特定酶（如蛋白酶、核酸酶等）降解细胞内的蛋白质和核酸，使核酸得以释放。
2.2 核酸溶解核酸溶解是在细胞破碎后，将核酸从其他组分中溶解出来。
核酸的溶解需要满足一定的条件，如适当的温度、pH值和离子浓度等。
常见的核酸溶解缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、EDTA缓冲液和含有盐的缓冲液等。
这些缓冲液能够提供适当的pH值和离子浓度，有利于核酸的稳定和溶解。
2.3 核酸分离核酸分离是将溶解的核酸与其他杂质分离的过程。
核酸的分离可通过差速离心、柱层析和电泳等方法实现。
差速离心是利用离心力将核酸与其他物质分离的方法。
由于核酸的分子量较大，其在离心过程中沉降速度较慢，从而与其他物质分离。
柱层析则是利用柱状填料的吸附、分配和排除等原理，通过溶液在柱中的流动进行分离，将核酸与其他组分分离。
电泳是利用核酸在电场中的迁移速度的差异进行分离的方法。
2.4 核酸纯化核酸纯化是将分离的核酸进一步纯化，去除可能存在的杂质。
