细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。

细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。

细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。

本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。

细胞冻存篇冻存原则细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。

如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。

在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。

DMSO使用注意事项DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。

程序冻存液配方程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。

血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。

根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。

细胞冻存密度细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。

提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。

冻存操作方法方法一：使用程序冻存盒使用程序降温盒是最常用的冻存方法。

市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。

降温盒须恢复室温后再使用。

根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。

操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存▲ 使用冻存盒操作示意图方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。

细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。

此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。

细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。

首先，培养细胞是实验的第一步。

细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。

培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。

接下来，要准备细胞冻存液。

细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。

常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。

其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。

然后进行细胞的冷冻。

将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。

低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。

细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。

在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。

冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。

细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。

复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。

一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。

此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。

总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。

但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。

因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。

细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。

细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。

细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。

如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。

胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。

如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。

采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。

慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。

使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。

液氮温度达-19 6℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。

（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。

（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。

可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。

首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。

细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。

而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。

一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。

最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。

细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。

如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。

目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。

细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。

细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。

三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。

慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。

3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。

4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。

细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。

2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。

4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。

细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。

细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。

与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。

细胞复苏的方法如下：1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。

在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。

细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。

如果37℃水浴时间延长，会提高细胞死亡率。

2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。

如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。

3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。

24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。

三天可进行一次换液。

当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。

此外，还有一些注意事项：1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。

如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。

由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。

2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。

注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。

4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。

细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存：一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里，细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。

今天呀，我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿，这里面的门道可多着呢，就像走钢丝，容不得半点马虎。

一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一：前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前，得把“战场”布置好。

先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍，就像给它做个全面的SPA，确保里面一尘不染。

接着，打开水浴锅，把水温调到37℃，这温度可不能出差错，多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了，少一度就像是在冷水里打哆嗦，都不利于细胞恢复生机。

准备好相应的培养液，这就像是细胞的“营养套餐”，没它细胞可活不下去。

步骤二：复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候，感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。

那冻存管冻得直冰手，得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻，要不停地轻轻晃动，就像是在鼓励细胞：“小宝贝们，快快醒来啊！”这时候心里默默祈祷着，可别出啥岔子。

在小细胞们还迷糊着的时候，把它们转移到含有培养液的离心管里，离心的过程又像一场小小的筛选，把那些还没适应过来的杂质去除，留下顽强的细胞。

最后把细胞接种到培养瓶里，就像给它们安家落户啦，盼着它们在新家里茁壮成长。

二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一：选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。

一般是包括培养液、血清和保护剂（像是二甲基亚砜这类的神奇物质）。

血清就像保护层里的柔软衬里，给细胞温暖的呵护，而保护剂则像坚韧的外壳，防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。

这三者的比例得拿捏得死死的，就像厨师做菜时放盐的量，多一点少一点都不行。

步骤二：缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里，标记好细胞类型、日期等信息，这就好比给细胞上户口，省得以后找不到“人”。

然后要进行程序降温。

想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物，得一步步慢慢适应越来越冷的环境。

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干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。

(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。

2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。

3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。

(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。

(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。

4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。

(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。

(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。

5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。