细胞冻存和复苏

实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。

该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。

本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。

实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。

然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。

注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。

2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。

然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。

3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。

② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。

然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。

注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。

然而，DMSO也具有一定的毒性。

因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。

2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。

在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。

3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。

在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。

同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。

总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。

如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。

细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。

此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。

细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。

首先，培养细胞是实验的第一步。

细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。

培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。

接下来，要准备细胞冻存液。

细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。

常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。

其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。

然后进行细胞的冷冻。

将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。

低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。

细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。

在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。

冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。

细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。

复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。

一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。

此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。

总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。

细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。

它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。

然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。

本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。

细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。

1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。

首先，需要确保细胞的纯度和活力。

通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。

同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。

2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。

常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。

这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。

在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。

3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。

一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。

细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。

冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。

冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。

细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。

1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。

在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。

解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。

因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。

2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。

下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。

技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。

具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。

为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。

而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。

2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。

一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。

操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。

采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。

2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。

一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。

保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。

3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。

首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。

然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。

最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。

4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。

将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。

然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。

最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。

5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。

总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。

细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。

在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。

细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。

温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。

细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。

因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。

由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。

因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。

一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。

冰冻时还要加入5〜10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。

因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。

在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。

一、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没有及时稀释接种KEY：1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。

Protocal（以贴壁细胞系tsA201 为例）1. •准备材料：37C〜40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。

培养液孵温至于37 °C3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。

将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。

细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。

想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。

1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。

这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。

要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。

对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。

1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。

市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。

这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。

用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。

你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。

1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。

这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。

通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。

记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。

2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。

复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。

2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。

这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。

解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。

细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。

（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。

（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。

（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。

6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。

2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。

注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。

加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。

3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。

4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。

5.离心800r每分钟，4min。

在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。

细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。

细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

细胞冻存方法预先配制冻存液：20%血清培养基10%DMSO （二甲基亚砜）取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

注意事项：在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。

高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。

在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。

这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。

步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。

2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。

3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。

4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。

复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。

2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。

观察细胞的生长和形态变化。

原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。

冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。

细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。

当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。

注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。

2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。

3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。

通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。

4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。

不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。

5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。

细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。

下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。

细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。

通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。

2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。

3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。

4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。

5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。

随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。

6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。

细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。

待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。

2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。

培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。

3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。

4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。

冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。

同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。

细胞冻存（Cell Freezing）和复苏技术原理和操作步骤一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。

如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。

液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。

使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤5。

）6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等。

细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。

确保细胞在保存前是健康和活跃的。

2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。

3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。

4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。

常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。

5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。

6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。

二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。

培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。

2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。

3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。

4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。

5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。

6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。

1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。

2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。

通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。

3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。

例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。

4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。

液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。

细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。

细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。

细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。

4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。

细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。

2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。

3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。

细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。

在冻存前一天最好换一次培养液。

（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。

依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。

用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。

以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。

以后取出冻存管移入液氮容器内。

在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。

已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。

因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。

（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。

细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。

冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。

在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。

2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。

最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。

可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。

3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。

这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。

4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。

这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。

总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。

只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。