实验十一细胞的冻存与复苏 ppt课件

实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。

该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。

本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。

实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。

然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。

注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。

2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。

然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。

3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。

② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。

然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。

注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。

然而，DMSO也具有一定的毒性。

因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。

2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。

在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。

3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。

在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。

同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。

总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。

如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。

细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。

冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。

（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。

给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。

2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。

3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。

4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。

5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。

6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。

7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。

8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。

（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。

2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。

细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。

如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。

目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。

细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。

细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。

三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。

慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。

3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。

4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。

细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。

2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。

4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。

细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。

本文将对这些问题进行讲解。

一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。

由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。

复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。

2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。

3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。

换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。

2、向细胞培养管中加入新的培养液。

3、培养之前搅拌均匀。

4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。

三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。

传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。

每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。

2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。

3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。

4、传代时需要更换新的培养基。

四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。

冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。

2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。

3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。

总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。

只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。

细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。

细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。

下面将详细讨论这些过程。

细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。

2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。

3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。

4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。

5.定期观察细胞的生长情况。

细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。

3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。

4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。

5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。

冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。

3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。

4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。

5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。

6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。

7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。

细胞冻存与复苏细胞储存于液氮中，温度达-196°C，理论上储存时间是无限的。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快存，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存【用品】（1）5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3）DMSO或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好是对数生长期的细胞，已将长满的细胞冻存后生存率低。

在冻存前一天最好换一次培养液。

（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生生长的细胞则不需要处理。

依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配好的冻存培养液（含10%的DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5*106/mL~1*107/mL。

用吸管轻轻地吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。

细胞的复苏【用品】培养液吸管离心管培养瓶37°C温水【步骤】（1）从保存冻存管的架子中取出冻存管应直接投入37°C温水中，并不时摇动令其尽快融化。

如果冻存管封闭不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部。

因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。

（2）从37°C水浴中取出冻存管，用酒精消毒后拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再重复用培养液洗一次。

（3）用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37°C温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。

如果复苏时细胞密度较高要及时传代。

背景知识：细胞培育的传代及平时保持过程中，在培育用具、培育液及各样准备工作方面都需大批的耗资，并且细胞一旦走开活体开始原代培育，它的各样生物特征都将渐渐发生变化并跟着传代次数的增添和体外环境条件的变化而不停有新的变化。

所以实时进行细胞冻存十分必需。

细胞冻存及复苏的基来源则是慢冻快融，实考证明这样能够最大限度的保留细胞活力。

当前细胞冻存多采纳甘油或二甲基亚砜 (DMSO)作保护剂，这两种物质能提升细胞膜对水的通透性，加上迟缓冷冻可使细胞内的水分溢出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，进而减少因为冰晶形成造成的细胞损害。

复苏细胞应采纳快速消融的方法，这样能够保证细胞外结晶在很短的时间内即消融，防止因为迟缓消融使水分渗透细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

细胞冻存操作步骤：1.配制含 6-10%DMSO的 10%小牛血清的冻存培育液，冰上预冷；2.取对数生长久的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml 离心管；3.离心 500rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培育液，由慢至快，滴入配制好的冻存培育液，用吸管柔和吹打使细胞平均（在冰长进行）；一般一个小方瓶冻一支或许一个10cm培育皿冻 2支。

5.将细胞分装入冻存管中，每管 1ml（若冻存多于 1 支，则每支要平均分装）；6.在冻存管上注明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70 ℃冰箱中放 3 天左右，拿出冻存管，移入液氮容器内。

注意事项：1 ．从增殖期到形成致密的单层细胞从前的培育细胞都能够用于冻存，但最好为对数生长久细胞。

在冻存前一天最好换一次培育液；2．将冻存管放入液氮容器或从中拿出时，要做好防备工作，免得冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培育液。

细胞复苏操作步骤：1.从液氮容器中拿出冻存管，快速浸入 37℃温水中，并时时摇动令其赶快融化；2.当最后一小块冰快消融时，将冻存管放在冰浴上。