现代分子生物学技术

☎将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体 进行反应。 主要步骤：
蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜 靶蛋白的免疫学检测
Step 1.靶蛋白于第一抗体（一抗）反应
Step
2.与
聚丙烯酰胺凝胶电泳
☎聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1到1000个碱基对之间
☻凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓 度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
分子生物学研究方法
基因操作
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交
凝胶电泳
细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变 PCR扩增等
核心技术
一、发展历程及基础
（一）三大成就 ：
1、 40年代确定了遗传信息的携带者，即基 因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗 传的物质基础问题；
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
☻在紫外线的照射下 结合溴化乙锭（简称 EtBr）的DNA分子发 出荧光,每条DNA带中
仅含有0.05μg的微
量DNA也可以被清晰 地检测出来。
电泳操作基本程序
称样
溶解
加热
制板来自百度文库
倒胶
取样 电泳
点样 检测
结果分析
（二） 核酸的分子杂交
将带有互补的特定核苷酸序 列的单链DNA或RNA混合在一 起，其相应的同源区段就会 退火形成双链结构。如果退 火的核酸来自不同的生物有 机体，所形成的双链分子就 被称为杂种核酸分子。
据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非 放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探 针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记 探针。
标记物:核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等
非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素
（1）双链DNA探针 缺口平移法
能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
☻细胞或组织的固定：载玻片 ☻组织细胞杂交前的预处理: 用去垢剂或蛋白酶除
去核酸表面蛋白质
☻探针的选择和标记 ☻杂交 ☻杂交结果检测
检测重组体克隆的菌落杂交技术
5、探针的标记
探针的种类:根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根
Rosalind Franklin
X-ray 光源
DNA
成像
Maurice Wilkins 1953- Franklin & Wilkins
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
Jacob and Monod
（二）两大技术保证：
☻ 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合 酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。
☻ 同时该酶具有从5‘→3’的核酸外切酶活性,能从切口的5‘端 除去核苷酸。
☻ 由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从 而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放 射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
☻常用 的荧光 染料： C5、C3 等
2.Northern blotting （RNA印迹技术）
是将RNA分子从电泳凝胶 转移到硝酸纤维素滤膜或 其他化学修饰的活性滤纸 上，进行核酸杂交的一种 实验方法。
分离的 mRNA (不同长度)
探针 DNA结合
3.Western blotting（蛋白质杂交技术）
阴极
DNA加样孔
阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA 移动的快
电泳缓冲液
DNA和RNA被称为多聚阴离子（polyanions），核酸分子放
置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强
度下，DNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和
构型。
琼脂糖凝胶电泳
☎琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间
标记
的第
二抗
体（
Ste p 3. 显
酶标 二抗 ）反 应
色
反
应
：
酶
促
反
应
4、原位杂交（in situ hybridization ）
DNA的定位
RNA定位
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进 行杂交，称为原位杂交。
特点:
能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的 靶序列灵敏度高
DNA/DNA 或DNA/RNA
不同 温度 下DNA 的构 型变 化
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电 泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管 或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的， 因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交”。
材料：尼龙滤膜 、硝酸纤维素滤膜 、二乙氨基乙基纤维素滤
1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶
限制性酶 连接酶
2. DNA的核苷酸序列分析技术
二、 DNA操作技术
（一） 核酸的凝胶电泳
基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用 下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和 电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与分子的摩 擦系数成反比
膜（DEAE）
步骤：
第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印 迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和 噬菌斑印迹法;
第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的 DNA或RNA探针进行杂交
1、Southern Blotting（DNA印迹技术）
Southern Blotting的过程 （1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA （2）通过电泳液的移动转移胶中的DNA （3）固定胶中的DNA （4）预杂交和杂交（放射性和荧光检测） （5）结果检测