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实验五叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
第三章第二节细胞器—系统内的分工合作1．如何分离细胞器：差速离心法（1）线粒体———“动力车间”半自主性细胞器分布：普遍存在植物细胞和动物细胞中，一般均匀地分布在细胞质基质中，但在活细胞中能自由的移动，往往在细胞内新陈代谢旺盛的地方比较集中，如：飞行鸟类的胸肌。
一般动物细胞中的线粒体数量比植物中的多。
结构：两层膜，内膜的某些部位向线粒体内腔折叠形成“嵴”使内膜面积大大增大基质和嵴充满了与有氧呼吸有关的酶，基质还含有少量的DNA、RNA和核糖体。
生物学意义：活细胞进行有氧呼吸的主要场所（2）叶绿体—“养料制造工厂”“能量转换站”半自主性细胞器光学显微镜下—椭球型或球形（藻类的叶绿体形态大而且多样）电子显微镜下—内部结构结构：双层膜（具有选择透性，使内部与外界分开）；基粒（类囊体结构堆叠成片层结构，分布光合色素，具吸收、传递、转换光能作用，含有与光合作用有关的酶）；基质：充满了内部空间，含有许多进行光合作用的酶，含有少量的DNA、RNA和核糖体。
功能：光合作用的场所（3）内质网—脂质合成的“车间”形态：电镜下观察，网状膜片层结构分布：多数动植物细胞都有，分布于整个细胞基质类型：光滑型膜表面光滑脂类、糖类的合成有关粗糙型膜表面分布许多小颗粒状核糖体与蛋白质合成有关结构：单层膜结构联结成网，外接细胞膜，内连核外膜，具有网腔。
（4）核糖体—“生产蛋白质的机器”无膜结构形态：电镜下观察，椭球型粒状小体分布：附着在内质网上附着型游离于细胞质中游离型功能：细胞内合成蛋白质的场所，喻为蛋白质的“装配机器”（5）高尔基体—“发送站”发现：1898年意大利医生高尔基首次在神经细胞中发现分布：普遍分布于动植物细胞中，也存在于原生动物和真菌结构：单层膜由一些排列较整齐的扁平囊堆叠而成，周围有大量囊泡结构。
功能：与细胞的分泌物形成有关，自身无合成蛋白质功能，可以对蛋白质进行加工和运转被喻为蛋白质的“加工厂”植物细胞分裂时，高尔基体与细胞壁的形成有关（6）中心体分布：动物细胞和低等植物细胞中，常位于细胞核附近结构：两个相互垂直排列的中心粒及其周围物质组成，无膜结构功能：动物细胞的中心粒与有丝分裂有关（7）液泡分布：植物细胞质中，不是所有的植物细胞都具有大液泡，刚分裂产生的细胞如根尖生长点细胞、顶端分生组织细胞等没有大液泡。
植物细胞与组织的实验原理植物细胞和组织的实验原理涵盖了多个方面，包括细胞结构的观察、组织培养和细胞分离等。
以下是对植物细胞与组织实验原理的详细解释：一、植物细胞结构观察实验原理：1. 细胞质染色观察：通过荧光染料如卡伦登染料或结构染料如甲苯胺蓝B染色剂对细胞膜、细胞质和核等结构进行染色，然后通过荧光显微镜或透射电子显微镜观察和记录。
2. 细胞器观察：通过不同的实验方法，如细胞器标记、免疫荧光染色或电镜观察等，来观察植物细胞中的细胞器，如叶绿体、线粒体、高尔基体、内质网和液泡等。
3. 细胞膜透明化和显微观察：通过染色和脱水技术，将植物细胞膜透明化，然后使用显微镜观察细胞膜的形态结构和细胞器的位置，以了解细胞内部结构的分布情况。
4. 细胞骨架的观察：通过染色和显微镜观察，可以研究植物细胞骨架的组成和结构，如微丝、中间丝和微管等，同时也可以观察细胞骨架在细胞分裂和细胞形态变化中的作用。
二、植物组织培养实验原理：1. 组织培养基的配制：根据植物组织的生长需求，配制含有不同植物激素和养分的培养基，确保组织的生长和分化。
2. 组织的获取和处理：从植物的茎、叶、根等部位获取组织，并通过消毒处理获得无菌组织。
3. 组织培养和细胞分裂：将组织接种在含有培养基的培养皿中，在合适的温度、光照和湿度条件下培养，通过细胞分裂和组织分化来获得较大量的细胞和组织。
4. 细胞分化和组织再生：通过调节培养基中激素的类型和浓度，可以促进细胞分化和组织再生，形成新的植株。
三、植物细胞分离实验原理：1. 细胞溶解：将植物茎、叶、根等组织切碎，使用酶解液或溶解液对细胞进行溶解，以释放细胞内的物质。
2. 细胞筛选：通过离心和过滤等方法，将细胞的碎片和其他细胞组分分离出来，然后使用显微镜或流式细胞仪等设备对特定细胞进行观察和分析。
3. 细胞培养：将分离的细胞接种在含有培养基的培养皿中，促使细胞再次生长和分裂。
4. 细胞检测和分析：通过染色、免疫荧光染色、酶活性测定等方法，对分离的细胞进行检测和分析，以研究细胞的类型、结构和功能。
细胞器——系统内的分工合作1、分离各种细胞器的方法：差速离心法。
2、线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的“动力车间”。
细胞生命活动所需的能量，大约95%来自线粒体。
3、叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞含有的细胞器，是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换车间”。
4、内质网是膜连接而成的网状结构，是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的“车间”。
5、内质网的类型：粗面内质网（上有核糖体）、滑面内质网6、高尔基体主要是对来自内质网的蛋白质进行加工、分类和包装的“车间”及“发送站”，功能：与动物细胞分泌物形成有关；与植物细胞细胞壁形成有关。
7、核糖体的功能：是“生产蛋白质的机器”分布：有的附着在内质网上，有的游离在细胞质中。
8、溶酶体：是“消化车间”，内部含多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌。
9、液泡：调节植物细胞内的环境，充盈着的液泡还可以使植物细胞保持坚挺，主要存在于植物细胞中。
10、中心体：由两个互相垂直的中心里及周围物质组成，与细胞的有丝分裂有关，分布于动物和某些低等植物的细胞中。
11、细胞质的组成：主要包括细胞器和细胞质基质。
12、细胞质基质存在状态：胶质状态成分：含有水、无机盐、脂质、糖类、氨基酸、核酸和多种酶功能：是多种化学反应进行的场所13、叶绿体分布：叶肉细胞中、形态：扁平的梭形、颜色：绿色14、线粒体普遍存在于动植物细胞中，形态多样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等。
15、细胞骨架是由蛋白质纤维围成的网架结构，与细胞运动、分裂、分化以及物质运输、能量转换、信息传递等生命活动密切相关。
16、分泌蛋白：有些蛋白质是在细胞内合成后，分泌到细胞外气作用的，这类蛋白质叫做分泌蛋白。
17、分泌蛋白合成途径：核糖体（合成肽链）→内质网（加工成具有一定空间结构的蛋白质）→囊泡→高尔基体（进一步修饰加工）→囊泡→细胞膜→细胞外18、生物膜的组成：细胞器膜和细胞膜、核膜等结构19、分泌蛋白在形成过程中，要发生不同膜的融合，膜融合的原理是膜的流动性。
一、实验目的1. 熟悉植物细胞分离实验的基本原理和方法。
2. 掌握植物细胞器分离纯化的操作技能。
3. 了解不同细胞器在分离过程中的沉降特性。
二、实验原理植物细胞分离实验是细胞生物学和分子生物学研究的重要技术之一。
通过采用差速离心和密度梯度离心等方法，可以将植物细胞中的各种细胞器分离纯化，从而研究其结构和功能。
本实验采用差速离心法分离植物细胞中的线粒体和叶绿体。
三、实验用品1. 植物材料：洋葱鳞片叶或菠菜叶片。
2. 实验试剂：生理盐水、蔗糖、盐酸、缓冲液、龙胆紫染液。
3. 实验仪器：离心机、匀浆器、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、培养皿、铅笔。
四、实验步骤1. 细胞破碎：将植物材料放入匀浆器中，加入适量生理盐水，高速匀浆，破碎细胞。
2. 差速离心：将匀浆液转移至离心管中，以3000r/min的速度离心10分钟，分离出细胞碎片。
3. 叶绿体分离：将离心后的上清液转移至新的离心管中，以5000r/min的速度离心10分钟，分离出叶绿体。
4. 线粒体分离：将离心后的沉淀物重新悬浮于生理盐水中，以12000r/min的速度离心15分钟，分离出线粒体。
5. 染色：将分离出的线粒体和叶绿体分别加入适量龙胆紫染液，染色5分钟。
6. 观察：将染色后的线粒体和叶绿体分别滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。
五、实验结果1. 叶绿体：呈绿色，呈球形或椭球形，细胞器较大，直径约2-4微米。
2. 线粒体：呈蓝色，呈杆状或圆形，细胞器较小，直径约0.5-1微米。
六、实验讨论1. 在差速离心过程中，不同细胞器的沉降速度不同，因此可以通过调整离心速度和时间，实现细胞器的分离纯化。
2. 本实验中，叶绿体和线粒体的分离效果较好，说明差速离心法适用于植物细胞器的分离。
3. 实验过程中，要注意控制匀浆时间和离心速度，以免影响细胞器的结构和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物细胞中的叶绿体和线粒体，并通过显微镜观察了其形态特征。
叶绿体的分离实验报告叶绿体的分离实验报告引言：叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它具有自主复制的能力，并且在光合作用中起着重要的作用。
为了更好地了解叶绿体的结构和功能，我们进行了一系列的实验，其中包括叶绿体的分离实验。
本报告将详细介绍我们的实验步骤、结果和讨论。
实验步骤：1. 实验前准备：a. 准备一定量的新鲜叶片样本，最好选择绿色较浓的叶片。
b. 准备所需的实验器材，包括离心机、显微镜等。
c. 准备叶绿体分离液，可以使用含有蔗糖、EDTA和缓冲液的溶液。
2. 叶绿体的分离：a. 将新鲜叶片样本切碎，并加入适量的叶绿体分离液中。
b. 将混合液放入离心管中，进行离心。
离心的速度和时间可以根据实际情况进行调整。
c. 离心后，可以观察到离心管中的分层现象。
叶绿体通常会沉淀在离心管的底部。
d. 小心地将上层液体倒掉，留下叶绿体沉淀。
e. 加入适量的缓冲液，轻轻悬浮叶绿体沉淀，使其均匀分散。
3. 叶绿体的观察：a. 取一滴悬浮的叶绿体液滴在载玻片上，并盖上盖玻片。
b. 使用显微镜进行观察。
可以调节放大倍数，以便更清晰地观察叶绿体的结构。
c. 观察叶绿体的形态、颜色和大小等特征。
实验结果：通过以上实验步骤，我们成功地分离出了叶绿体，并观察到了其形态和结构。
1. 形态观察：a. 叶绿体呈现绿色或浅绿色，具有一定的透明度。
b. 叶绿体的形态多样，有些呈椭圆形，而有些则呈圆形或不规则形状。
c. 叶绿体的大小也有差异，一般直径在2-10微米之间。
2. 结构观察：a. 在显微镜下观察，可以看到叶绿体具有双层膜结构，外层膜与内层膜之间形成了叶绿体间隙。
b. 叶绿体内部含有一种绿色的色素，称为叶绿素。
叶绿素是进行光合作用的关键物质。
c. 叶绿体内还含有一系列光合作用所需的酶和蛋白质，这些物质协同工作，完成光合作用过程。
讨论：通过本次实验，我们成功地分离出了叶绿体，并观察到了其形态和结构。
叶绿体是植物细胞中的重要细胞器，它在光合作用中起着至关重要的作用。
叶绿体分离的实验报告叶绿体分离的实验报告引言：叶绿体是植物细胞中的一种重要细胞器，其主要功能是进行光合作用，将光能转化为化学能，为植物提供能量。
叶绿体分离是一种常用的实验方法，通过分离叶绿体，可以更好地研究其结构和功能。
本实验旨在探究叶绿体分离的方法和步骤，并观察叶绿体的形态和特征。
材料与方法：1. 鲜嫩的植物叶片：本实验选择了菠菜叶片作为实验材料，因其叶绿体含量丰富。
2. 0.5% EDTA溶液：用于破坏叶片细胞壁，释放叶绿体。
3. 0.4 M 蔗糖溶液：用于制备蔗糖梯度离心液。
4. 离心管和离心机：用于离心分离叶绿体。
5. 高速离心管：用于收集纯化后的叶绿体。
实验步骤：1. 取一片新鲜的菠菜叶片，并用去离子水清洗干净，去除表面的杂质。
2. 将叶片切碎，放入离心管中，并加入适量的0.5% EDTA溶液。
3. 将离心管放入冰箱中静置20分钟，使叶绿体充分释放。
4. 取出离心管，用玻璃棒轻轻搅拌叶片，使细胞破裂，释放叶绿体。
5. 将离心管置于冰上，使用低速离心机以3000 rpm离心10分钟，沉淀下来的为叶绿体。
6. 将上清液倒掉，用去离子水洗涤沉淀2-3次，以去除杂质。
7. 加入适量的0.4 M 蔗糖溶液，将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心20分钟，使叶绿体沉积在梯度液体中。
8. 将上清液倒掉，离心管内的梯度液体分为不同层次，叶绿体沉积在较低的层次中。
9. 使用移液管将叶绿体取出，放入高速离心管中。
10. 使用高速离心机以15000 rpm离心10分钟，将叶绿体沉淀下来。
11. 倒掉上清液，收集纯化后的叶绿体。
结果与讨论：通过本实验，我们成功地分离出了菠菜叶片中的叶绿体。
观察分离后的叶绿体，可以发现其呈现绿色，具有椭圆形状，大小约为2-5微米。
叶绿体在显微镜下呈现出明显的双膜结构，其中内膜形成了许多类似硬币的结构，称为类囊体。
类囊体中含有叶绿素，是进行光合作用的关键结构。
此外，叶绿体内还含有DNA和一些酶，用于合成光合作用所需的物质。
简要说明原生质体分离的方法原生质体是植物细胞中的一种重要细胞器，它在细胞的生理活动中起着关键作用。
为了研究和利用原生质体，科学家们开展了一系列的实验，其中最重要的一步就是分离原生质体。
本文将以简要说明原生质体分离的方法为标题，介绍几种常用的原生质体分离方法。
一、低速离心法低速离心法是最常用的原生质体分离方法之一。
该方法的原理是通过离心将细胞破碎后的混合液分离成不同密度的组分。
具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液。
2. 用离心机以较低的转速离心，使细胞破碎并分离成三个层次的组分：上层是液相，含有溶质和溶剂；中间层是细胞碎片和细胞核碎片；下层是较重的原生质体。
3. 将下层的原生质体用吸管或移液器小心地取出，并用缓冲液洗涤去除杂质。
二、梯度离心法梯度离心法是一种通过调整离心管中梯度浓度来分离不同细胞器的方法。
该方法可以得到纯度较高的原生质体。
具体步骤如下：1. 准备一个离心管，在离心管中加入不同浓度的梯度液，通常是葡萄糖或蔗糖梯度。
2. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。
3. 将细胞破碎液轻轻地加入离心管中，避免与梯度液混合。
4. 用离心机以较高的转速离心，离心后不同细胞器会在离心管中分层。
原生质体一般会沉于梯度液的某一位置。
5. 小心地用吸管或移液器将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。
三、差速离心法差速离心法是一种通过调整离心速度来分离原生质体的方法。
该方法适用于分离密度较接近的细胞器。
具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。
2. 用低速离心将细胞破碎液离心一次，去除细胞碎片和细胞核碎片。
3. 将上一步得到的上清液转移至另一个离心管中，用较高的离心速度离心，原生质体会沉于离心管的底部。
4. 小心地将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。
四、亲和层析法亲和层析法是一种通过利用生物分子之间的特异性相互作用来分离原生质体的方法。
该方法适用于需要分离特定蛋白质的情况。
植物细胞器的分离一、叶绿体的分离：1.实验原理：采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。
2.实验材料及试剂：成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。
3.实验器材：SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3mol/L*182.17g/mol=54.651gEDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/molm= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 gLEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/molm=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g4.制备方法4.1 叶绿体粗提物的制备（1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min),（2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,（3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2 000 g在3000r/min离心10min,所得沉淀即为叶绿体粗提物,（5）.将此粗提物悬浮于7.5 mL细胞器分离缓冲液中备用。
4.2 密度梯度离心制备完整叶绿体（1）.用50 mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18 mL含52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.8),25 mmol/L EDTA(pH为8.8)的混合液,上面用7 mL含30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.0)、25 mmol/LEDTA(pH为8.0)的混合液覆盖。
（2）. 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20 kr/min离心30 min。
（3）.处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。
（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。
5.叶绿体的显微鉴别：叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。
二、线粒体的分离1.实验原理：利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
2.实验材料及试剂：实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase和RNase为上海生物工程技术服务有限公司产品;溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242 g Tris溶于适量蒸馏水中,加入57. 1 mL冰乙酸, 100 mL0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至1 L即为50×TAE转换为1 ×TAE稀50倍)缓冲液A:蔗糖0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA 0. 1%,PVP0. 5%, 0. 1%β-巯基乙醇,pH= 7. 5.缓冲液B:蔗糖0. 5 mol·L-1,Tris-Cl 50mmol·L-1, pH= 7. 5.缓冲液C:蔗糖0. 6 mol·L-1, Tris-Cl10mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1, pH= 7. 2.缓冲液D: 0. 1 mol·L-1Tri-HCl(pH= 8. 0),0. 05 mol·L-1EDTA (pH= 8. 0), 0. 1mol·L1NaCl,10%SDS, 0. 01mol·L-1β-巯基乙醇.EDTA：配置体积：100ml , 浓度: 0.5mol/L, 分子量：292.248g/molm= 0.5mol/L*100mL /*292.248g/mol =14.6124g.蔗糖:配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:342.3g/molm= 0.5mol/L *100mL*342.3g/mol=17.115g.LTris-Cl:配置体积:100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:121.14g/molm= 0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.蔗糖:配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/l , 分子量:342.3g/molm=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.蔗糖: 配置体积：100ml , 浓度:0.6mol/L ,分子量:342.3g/molm= 0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.Tris-Cl:配置体积：100ml, 浓度：0.1mol/L , 分子量:121.14g/molm= 0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.EDTA:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/l , 分子量：292.248g/molm= 0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.NaCl : 配置体积：100ml ,浓度： 0.1mol/L , 分子量:58.44g/molm= 0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.β-巯基乙醇: 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：78.13g/mol m= 0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.3.实验仪器:超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ= 15 cm)、无菌纱布、大离心管(50mL)、水浴锅、微量离心管(1. 5 mL)、微量离心机(1. 5mL管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.4.实验方法:（1）.采集叶片30 g左右(采集前需暗培养24～28 h,以减少叶片组织所含糖类的污染);(2).用蒸馏水洗涤2～3次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液A和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;(3).用6层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液A漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤, 2次滤液合并,补加缓冲液A至3～5mL·g-1试材,并将滤液分装于4个50mL无菌离心管中, 1 000 g离心10m in,收集上清液; (4).将上清液2 000 g离心10m in,再收集上清液于20 000 g离心10m in得到粗线粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL预冷的缓冲液B用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液1 000 g离心10min;(5).收集上清液于同一50mL无菌离心管,加入300μL 1mol·L-1的MgCl2至终浓度0. 01mo·L-1,和5mg·mL-1的DNaseⅠ至终浓度20μg·mL-1,冰浴放置1. 5～2 h,在冰浴液中加入1. 5mL 0.5mol·L1的EDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol·L-1;(6).将上述溶液小心铺于缓冲液C上(每管25mL C缓冲液), 18 000 g离心20 m in;收集沉淀重新悬浮于装20 mL预冷缓冲液C的离心管中,18 000 g离心10m in,得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在0～4℃条件下进行.5.显微鉴别:线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状，但必须借助健那绿(Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为1%健那绿染液（将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40摄氏度,使其充分溶解）.三、细胞核的分离:1.原生质体制备:（1）.取生长3～4 d的拟南芥悬浮系细胞1 700 rpm离心3min.静置沉淀，（2）.用0.4 mol L甘露醇短暂洗涤后置于20mL酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2, 11 mmol/LKH2PO4, 0.3mol/LMannitol, 0.3mol/Lsorbitol,甘露醇:配制体积：100ml , 浓度：0.4mol/l , 分子量:182.17g/molm= 0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.MES :配置体积：100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:213.25g/molm= 0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.CaCl2 :配置体积:100ml ,浓度：0.68mol/L ,分子量：110.98g/molm= 0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.KH2PO4 :配置体积：100ml ,浓度：0.11mol/L ,分子量：136.09g/molm= 0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.Mannitol甘露醇:配置体积：100ml , 浓度：0.3mol/L , 分子量:182.17g/mol m= 0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.Sorbitol山梨糖醇:配制体积：100ml , 浓度：0.3mol/L ,分子量：182.17g/molm= 0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.PVP-K30 : m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.(3).摇床设定70 rpm,28℃ .三层纱布过滤一次,(4).滤液经1 700 rpm离心3min,去上清，(5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))MES :配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/L，分子量：213.25m= 0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.sorbitol :配制体积：100ml ,浓度：0.2mol/L , 分子量：182.17g/molm= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.Manmitol:配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：182.17g/molm= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.2.细胞核与叶绿体的分离提纯为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在0～4℃下进行.2.1 细胞核与叶绿体的粗提(1). 向原生质体中加入含有0.5%Triton X-100的CSK缓冲液(100 mmol/L KCl,3mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose, 1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.(2).取120g离心10min,弃上清液.(3).用CSK缓冲液重悬沉淀,(4). 20μm孔径的滤膜过滤,(5).取120g离心10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.2.2 细胞核与叶绿体的纯化（1）. 把含有2.3mol L蔗糖的CSK缓冲液(100mmol LKCl, 3 mmol LMgCl2 ,1 mmol L EGTA(pH8.0), 10mmol LPIPES(pH6.8), 2.3 mol L sucrose,KCl :配制体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：74.6g/molm= 0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.MgCl2:配置体积：100ml ,浓度:0.3mol/L , 分子量：95.21g/molm= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.EGTA :配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：380.35g/molm= 0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035gPIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：302.40g/molm= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.sucrose:配置体积：100ml ,浓度： 2.3mol/L ,分子量：342.3g/molm= 2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.PMSF:配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L , 分子量：174.19g/molm= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.DTT :配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：154.25g/molm= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.（2）.再把60%percoll CSK缓冲液(60%percoll, 100 mol L KCl, 3mmol L MgCl2, 1 mmol L EGTA(pH8.0), 10 mmol LPIPES(pH6.8), 300mmol Lsucrose,KCl:配置体积：10ml , 浓度：100mol/L ,分子量:74.6g/molm= 100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/molm= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.EGTA: 配置体积：100ml , 浓度:0.1mol/L ，分子量：380.35g/molm=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g.PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L 分子量：302.40g/molm= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g.Sucrose:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：342.3g/molm= 0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g.PMSF：配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L ,分子量：174.19g/molm= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L 分子量：154.25g/molm= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.(3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象,(4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用CSK缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部,(5).最终形成三层溶液各居其层,(6). 200 g离心32min.溶液梯度层重新分布,(7).叶绿体沉于离心管底部,(8).细胞核分布于2.3mol/L蔗糖的CSK缓冲液与60%percoll CSK缓冲液的交界处一薄层中,(9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入2倍体积的CSK缓冲液,12000g离心5min,沉淀即为纯化的细胞核,(10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用1/400 mm2的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数.四、液泡的分离1原生质体分离步骤同细胞核的分离2.酶液配制酶的种类及配比根据酶解材料选择.应用的酶主要有果胶酶Y-23(pectolyase Y-23)、果胶酶R-10(离析酶macerozyme R-10)、纤维素酶RS(celllase "ONOZUKA")、纤维素酶R-10(cellulase "ONOZUKA"R-10)等.3.取材制备原生质体时要将冲洗过的组织，表面用70%的乙醇消毒30 s.有的研究者认为,将消毒后的组织剥去表皮并切成0. 5～2mm的小条块;对于难于剥去表皮的叶片,如禾本科的一些植物,可直接切成小条.适当的萎蔫有利于原生质体分离.4.分离与纯化1.将处理好的材料放入直径6cm的培养皿中.2.每2g材料加入酶液10mL,在25～30℃酶解6～12 h.3.每隔30m in镜检一次,直到有一定数量的原生质体释放出来为止.4.将酶解好的混合液通过尼龙网或金属网过滤,一般40～100μm.5.用含渗透剂浓度较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面,常用的渗透剂有（蔗糖、山梨醇或甘露醇）.6.将从叶片酶解得来的原生质体混合液在500×g离心5m in,使原生质体与杂质一起沉淀.7.去上清液后用25%的蔗糖使之悬浮,在1500×g离心5 m in,弃沉淀,将上清液用蒸馏水稀释3倍,再在500×g离心5m in;沉淀即为纯化的原生质体.5 液泡分离5.1 渗透裂解法（1）.酶法制备原生质体,在制备好的120mL原生质体悬浮液中迅速(15s内)加入等体积的介质溶液.（2）. 介质溶液成分及浓度为: 3mmol/LMgCl2, 1mmol/L DDT(二硫基苏糖醇), pH用HCl调节到8.MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/molm= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.DDT:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：154.25g/molm=cv/M=0.1mol/L*100mL*154.25g/mol=1.5425g.（3）.缓慢摇动后得到一个均一的悬浮液.用一个多浆叶的搅拌器搅拌2～4 m in,转速为每分钟15转.（4）.去掉搅拌器将悬浮液通过1mm孔径的塑料板过滤,然后再通过2层玻璃棉. （5）.得到的悬浮液在23×g下离心3m in使一些杂质沉淀,将上部清液转移到另一个250mL的离心管中,用一木条缓慢搅拌使其成为均一悬浮液;而残余的聚合团和碎片附着在木条上.去掉木条,在100×g下离团和碎片附着在木条上. (6).心悬浮液3m in,去掉上清液得到的沉淀即为含大量色素的液泡;而不含色素的液泡需要在1100×g离心3m in才能获得.。
