离心技术和细胞器分离

超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术.离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。

离心技术可分为制备型和分析型两类。

在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等.也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。

处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。

离心技术的范围相当广泛。

目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。

因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。

自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。

特别是在50年代以后发展的更快，例如,美国贝克曼(Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE）,日本的日立（HITACHI)公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。

从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。

美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离—检测，全部实现自动化;最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。

此外,离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。

虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。

在实际工作中用的最多的还是制备型离心。

本课程主要介绍制备型分离技术。

差速离心在细胞生物学领域的基本应用差速离心（Differential Centrifugation）是一种基础的分离技术，常用于细胞生物学领域。

它通过使用离心力，将混合物中组分按照密度或大小分离出来，从而可以获得纯净的细胞组分，进而进行研究和分析。

差速离心的基本原理是利用不同组分在离心过程中受到离心力的不同作用，使其在离心管中的位置发生变化。

该技术可以根据离心产生的离心力大小和离心时间来控制不同组分的分离效果。

差速离心在细胞生物学领域的基本应用主要有以下几个方面：1.分离细胞器和亚细胞组分：差速离心可以将细胞分离成细胞器和亚细胞组分。

通过逐级离心，可以获得比较纯净的线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器，进一步研究它们的结构和功能。

2.分离细胞核：差速离心能够利用细胞核较高的密度，将细胞核与细胞质分离。

通过离心操作，可以将细胞核纯化出来，用于DNA和RNA的提取、核蛋白的分离和研究细胞核的功能。

3.分离膜蛋白：膜蛋白是细胞中重要的功能分子，涉及许多生命活动，如信号转导、物质转运等。

差速离心可以分离细胞膜并提取膜蛋白，通过进一步的研究，可以了解膜蛋白的结构特征和功能机制。

4.分离细胞核糖体：细胞核糖体是合成蛋白质的重要细胞器，其大小和密度都与其功能相关。

差速离心可以通过离心力的调节，将细胞核糖体分离并获得不同大小的亚型，用于研究蛋白质合成的机制和调节。

5.分离细胞外泡：细胞外泡是细胞外释放的一种细胞间通讯方式，含有多种生物分子，如miRNA、mRNA、蛋白质等。

差速离心可以将细胞外泡纯化出来，并进行分析，探究其在细胞间通讯和疾病发生发展中的作用。

总的来说，差速离心是细胞生物学中常用的一种分离技术，可以根据细胞组分的不同密度和大小，将它们分离出来并纯化，为进一步研究细胞的结构、功能和相互作用提供基础。

该技术在细胞生物学、分子生物学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解生命的本质和探索疾病的发生机制提供了有力的工具。

《生命科学导论》重要知识点汇总六151.离心分离技术离心分离技术主要用于分离细胞器、生物大分子及其复合物。

分为差速离心和等密度离心两种,其中差速离心主要用于分离沉降系数不同的细胞组分,而等密度离心则用于分离沉降系数相似但密度不同的细胞组分。

差速离心是指低速与高速离心交替进行的离心方法,利用不同的离心速度所产生的不同离心力,使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来。

沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒,可以用此法分离。

差速离心是分离较大细胞器(如细胞核、线粒体)及各种大分子颗粒的基本手段。

等密度离心主要用于分离沉降系数差别不大，而密度相差较大的组分。

利用离心介质在离心管内形成一连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部。

离心一段时间后,不同密度的颗粒沉降到与其密度相同的位置停止沉降,聚集成区带,从而达到彼此分离的目的。

152.细胞化学技术1.细胞化学染色法为了显示蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，常利用显色剂与所检测物质的某个特殊基团特异性结合,通过颜色来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。

2.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术是对细胞内特异性蛋白质进行定位与定性的最有效的方法。

随着20 世纪70年代单克隆抗体技术的出现，免疫学技术取得了突飞猛进的发展,为细胞生物学的研究提供了强有力的手段。

常见的细胞内蛋白质分子定位技术有免疫荧光技术.免疫电镜技术。

3)原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交(hybridization in situ)。

153.定量细胞化学技术定量细胞化学技术是一种对细胞或组织中蛋白质或核酸等化学成分进行定量分析的技术,分为细胞显微分光光度技术和流式细胞仪技术。

细胞显微分光光度技术是利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞内的含量,包括用紫外光显微分光光度计测定和用可见光显微分光光度计测定。

差速离心法分离细胞器
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

起始的离心速
度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

收集沉淀，改用较高
的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

物体围绕中心轴旋转时会受到离心力f的作用。

当物体的质量为 m、体积为v、密度
为d、旋转半径为r、角速度为（弧度数/秒）时，可得：f=mω2r 或者f=v.d.ω2r （1）上述表明：被离心物质所受到的离心力与该物质的质量、体积、密度、离心角速度以及旋
转半径呈正比关系。

离心力越大，被离心物质沉降得越快。

在离心过程中，被离心物质
还要克服浮力和摩擦力的阻碍作用。

浮力f}和摩擦力f}}分别由下式表示：
f’=v.d’.ω2r （2）f’’=f dr/dt （3）其中d}为溶液密度，f为摩擦系数，dr/dt
为沉降速度（单位时间内旋转半径的改变）。

在一定条件下，可有：f=f’+f’’ v.d. ω2r =v.d’ω2r + f. dr/dt dr/dt =vω2r (d-d’)/f (4) 式(4)表明，沉降速度与被
离心物质的体积、密度差呈正比，与f成反比。

若以s表示单位力场（ω2r=1）下的沉降
速度，则 s=v (d-d’)/f s即为沉降系数。

沉降系数对于生物大分子来说，多数在
(1~)×10-13秒之间。

为应用方便起见，人们规定1×10-13秒为一个单位（或称1s）。

一般单纯的蛋白质在1~20s之间，较大核酸分子在4~s之间，更大的亚细胞结构在30～s 之间。

第三章细胞和细胞器及间质的分离细胞内各种结构的比重、大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，所以常用不同介质、不同转速、不同时间，通过分级离心，将细胞内各种结构组分（细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等）分离出来。

主要方法是：组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。

一、细胞的分离根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。

其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例，也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例，假设细胞为球形，则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V= 2g(ρc–ρs)r²9η遵循Stokes定律，其中：ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度，η为溶液粘度，r为细胞半径，g为重力加速度。

根据细胞直径（大小）的分离方法：主要是速度下降。

细胞在单位引力下，通过低密度介质，或在低离心力作用下，通过密度梯度沉降。

由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞越大沉降越快。

根据细胞密度分离是等密度分离，就是细胞在连续密度梯度分离介质中，在强离心作用下，细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面，并能保持平衡，在非连续密度梯度中，分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上，从而达到分离。

操作方法：（一）单位重力沉降法：分离介质主要是牛血清白蛋白，其分离的细胞活性高、费用也昂贵。

现已用蔗糖替代，仍能取得较好的分离效果。

1．在固定沉降池上方加入30ml PBS/BSA，含有细胞1×108于池底。

2．从池周边加入50ml PBS覆盖于样品上，不要使整个界面破坏。

3．下口接1％蔗糖梯度液，稍松下口，缓慢放入50ml 1%蔗糖梯度液，约10ml/min。

4．接通梯度混合仪，从下口加入1200ml 1~2%蔗糖梯度液，速度为50ml/min。

5．最后加入500ml 2.5%蔗糖梯度液。

6．整个沉降系统，于4℃，静置4h，这时细胞按大小先后沉降，未成熟的红细胞在先，成熟的网织红细胞在最后。