沙门氏菌检验(食品微生物学检验)

食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验1范围本标准规定了食品中沙门氏菌(S a l m o n e l l a)的检验方法㊂本标准适用于食品中沙门氏菌的检验㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2ħ~5ħ㊂2.2恒温培养箱:36ħʃ1ħ,42ħʃ1ħ㊂2.3均质器㊂2.4振荡器㊂2.5电子天平:感量0.1g㊂2.6无菌锥形瓶:容量500m L,250m L㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌培养皿:直径60mm,90mm㊂2.9无菌试管:3mmˑ50mm㊁10mmˑ75mm㊂2.10p H计或p H比色管或精密p H试纸㊂2.11全自动微生物生化鉴定系统㊂2.12无菌毛细管㊂3培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水(B P W):见A.1㊂3.2四硫磺酸钠煌绿(T T B)增菌液:见A.2㊂3.3亚硒酸盐胱氨酸(S C)增菌液:见A.3㊂3.4亚硫酸铋(B S)琼脂:见A.4㊂3.5 H E琼脂:见A.5㊂3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(X L D)琼脂:见A.6㊂3.7沙门氏菌属显色培养基㊂3.8三糖铁(T S I)琼脂:见A.7㊂3.9蛋白胨水㊁靛基质试剂:见A.8㊂3.10尿素琼脂(p H7.2):见A.9㊂3.11氰化钾(K C N)培养基:见A.10㊂3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.11㊂3.13糖发酵管:见A.12㊂3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷(O N P G)培养基:见A.13㊂3.15半固体琼脂:见A.14㊂3.16丙二酸钠培养基:见A.15㊂3.17沙门氏菌O㊁H和V i诊断血清㊂3.18生化鉴定试剂盒㊂4检验程序沙门氏菌检验程序见图1㊂图1沙门氏菌检验程序5操作步骤5.1预增菌无菌操作称取25g(m L)样品,置于盛有225m LB P W的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/m i n~ 10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有225m LB P W的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n㊂若样品为液态,不需要均质,振荡混匀㊂如需调整p H,用1m o l/m L无菌N a O H或H C l调p H至6.8ʃ0.2㊂无菌操作将样品转至500m L锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36ħʃ1ħ培养8h~18h㊂如为冷冻产品,应在45ħ以下不超过15m i n,或2ħ~5ħ不超过18h解冻㊂5.2增菌轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1m L,转种于10m LT T B内,于42ħʃ1ħ培养18h~24h㊂同时,另取1m L,转种于10m LS C内,于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂5.3分离分别用直径3m m的接种环取增菌液1环,划线接种于一个B S琼脂平板和一个X L D琼脂平板(或H E 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36ħʃ1ħ分别培养40h~48h(B S琼脂平板)或18h~24h (X L D琼脂平板㊁H E琼脂平板㊁沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1㊂表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌B S琼脂菌落为黑色有金属光泽㊁棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变H E琼脂蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色X L D琼脂菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心沙门氏菌属显色培按照显色培养基的说明进行判定养基5.4生化试验5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,必要时可延长至48h㊂在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2㊂表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢K A+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属K A+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属A A+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属A A+/-+/--非沙门氏菌K K+/-+/-+/-非沙门氏菌注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性㊂5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)㊁尿素琼脂(p H7.2)㊁氰化钾(K C N)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种㊂于36ħʃ1ħ培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果㊂将已挑菌落的平板储存于2ħ~5ħ或室温至少保留24h,以备必要时复查㊂表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢(H2S)靛基质p H7.2尿素氰化钾(K C N)赖氨酸脱羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性㊂5.4.2.1反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属㊂如尿素㊁K C N和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌㊂如有2项异常为非沙门氏菌㊂表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表p H7.2尿素氰化钾(K C N)赖氨酸脱羧酶判定结果---甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)-++沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)+-+沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注:+表示阳性;-表示阴性㊂5.4.2.2反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定㊂5.4.2.3反应序号A3:补做O N P G㊂O N P G阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性㊂5.4.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别㊂表5沙门氏菌属各生化群的鉴别项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇++ +山梨醇+++++水杨苷 +O N P G + +丙二酸盐 ++K C N ++注:+表示阳性; 表示阴性㊂5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定㊂5.5血清学鉴定5.5.1检查培养物有无自凝性一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原㊂首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性㊂对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定㊂5.5.2多价菌体抗原(O)鉴定在玻片上划出2个约1c mˑ2c m的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照㊂再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液㊂将玻片倾斜摇动混合1m i n,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应㊂O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;如果是由于V i抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1m L生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查㊂5.5.3多价鞭毛抗原(H)鉴定操作同5.5.2㊂H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~ 2次,自远端取菌培养后再检查㊂5.6血清学分型(选做项目)5.6.1O抗原的鉴定用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照㊂在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型㊂被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3㊁O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验㊂根据试验结果,判定O群㊂被O3㊁O10血清凝集的菌株,再用O10㊁O15㊁O34㊁O19单因子血清做凝集试验,判定E 1㊁E 4各亚群,每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果,没有O 单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对㊂不被A~F 多价O 血清凝集者,先用9种多价O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查,以确定O 群㊂每种多价O 血清所包括的O 因子如下:O 多价1 A ,B ,C ,D ,E ,F 群(并包括6,14群)O 多价2 13,16,17,18,21群O 多价3 28,30,35,38,39群O 多价4 40,41,42,43群O 多价5 44,45,47,48群O 多价6 50,51,52,53群O 多价7 55,56,57,58群O 多价8 59,60,61,62群O 多价9 63,65,66,67群5.6.2 H 抗原的鉴定属于A~F 各O 群的常见菌型,依次用表6所述H 因子血清检查第1相和第2相的H 抗原㊂表6 A ~F 群常见菌型 H 抗原表O 群第1相第2相A B BC 1C 2D (不产气的)D (产气的)E 1E 4E 4ag ,f ,s i ,b ,dk ,v ,r ,c b ,d ,r dg ,m ,p ,q h ,vg ,s ,t i 无无25,z 152,5无无6,w ,x 无 不常见的菌型,先用8种多价H 血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查,以第1相和第2项的H 抗原㊂8种多价H 血清所包括的H 因子如下:H 多价1 a ,b ,c ,d ,iH 多价2 e h ,e n x ,e n z 15,f g ,g m s ,g p u ,g p ,g q ,m t ,g z 51H 多价3 k ,r ,y ,z ,z 10,l v ,l w ,l z 13,l z 28,l z 40H 多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z 6H 多价5 z 4z 23,z 4z 24,z 4z 32,z 29,z 35,z 36,z 38H 多价6 z 39,z 41,z 42,z 44H 多价7 z 52,z 53,z 54,z 55H 多价8 z 56,z 57,z 60,z 61,z 62每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果,没有H 单因子血清的要用两个H 复合因子血清进行核对㊂检出第1相H 抗原而未检出第2相H 抗原的或检出第2相H 抗原而未检出第1相H 抗原的,可在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查㊂如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相㊂单相菌不必做位相变异检查㊂位相变异试验方法如下:简易平板法:将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查㊂小玻管法:将半固体管(每管约1m L~2m L)在酒精灯上溶化并冷至50ħ,取已知相的H因子血清0.05m L~0.1m L,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端㊂将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查㊂培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制㊂一般按原血清1ʒ200~1ʒ800的量加入㊂小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用㊂临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50ħ,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于36ħ培养后再做凝集试验㊂5.6.3V i抗原的鉴定用V i因子血清检查㊂已知具有V i抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌㊂5.6.4菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型㊂6结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(m L)样品中检出或未检出沙门氏菌㊂附录A培养基和试剂A.1缓冲蛋白胨水(B P W)A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000m LA.1.2制法将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10m i n,煮沸溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,高压灭菌121ħ, 15m i n㊂A.2四硫磺酸钠煌绿(T T B)增菌液A.2.1基础液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g蒸馏水1000m L除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节p H至7.0ʃ0.2,高压灭菌121ħ, 20m i n㊂A.2.2硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠(含5个结晶水)50.0g蒸馏水加至100m L高压灭菌121ħ,20m i n㊂A.2.3碘溶液碘片20.0g碘化钾25.0g蒸馏水加至100m L将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用㊂A.2.40.5%煌绿水溶液煌绿0.5g蒸馏水100m L溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌㊂A.2.5牛胆盐溶液牛胆盐10.0g蒸馏水100m L加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121ħ,20m i n㊂A.2.6制法基础液900m L硫代硫酸钠溶液100m L碘溶液20.0m L煌绿水溶液2.0m L牛胆盐溶液50.0m L临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分㊂A.3亚硒酸盐胱氨酸(S C)增菌液A.3.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000m LA.3.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55ħ以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10m L(称取0.1g L-胱氨酸,加1m o l/L氢氧化钠溶液15m L,使溶解,再加无菌蒸馏水至100m L即成,如为D L-胱氨酸,用量应加倍)㊂摇匀,调节p H至7.0ʃ0.2㊂A.4亚硫酸铋(B S)琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0m L柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g~20.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将前三种成分加入300m L蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20m L和30m L蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20m L和30m L蒸馏水中,琼脂加入600m L蒸馏水中㊂然后分别搅拌均匀,煮沸溶解㊂冷至80ħ左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀㊂将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀㊂调节p H至7.5ʃ0.2,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50ħ~55ħ㊂加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿㊂注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用㊂A.5H E琼脂(H e k t o e nE n t e r i cA g a r)A.5.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素 2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g~20.0g蒸馏水1000m L0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0m LA n d r a d e指示剂20.0m L甲液20.0m L乙液20.0m LA.5.2制法将前面七种成分溶解于400m L蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600m L蒸馏水内㊂然后分别搅拌均匀,煮沸溶解㊂加入甲液和乙液于基础液内,调节p H至7.5ʃ0.2㊂再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50ħ~55ħ倾注平皿㊂注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性㊂②甲液的配制硫代硫酸钠34.0g柠檬酸铁铵4.0g蒸馏水100m L③乙液的配制去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100m L④A n d r a d e指示剂酸性复红0.5g1m o l/L氢氧化钠溶液16.0m L蒸馏水100m L将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液㊂数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1m L~ 2m L㊂A.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(X L D)琼脂A.6.1成分酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂15.0g酚红0.08g蒸馏水1000m LA.6.2制法除酚红和琼脂外,将其他成分加入400m L蒸馏水中,煮沸溶解,调节p H至7.4ʃ0.2㊂另将琼脂加入600m L蒸馏水中,煮沸溶解㊂将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50ħ~55ħ倾注平皿㊂注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处㊂本培养基宜于当天制备,第二天使用㊂A.7三糖铁(T S I)琼脂A.7.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵(含6个结晶水)0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0m L氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g琼脂12.0g蒸馏水1000m LA.7.2制法除酚红和琼脂外,将其他成分加入400m L蒸馏水中,煮沸溶解,调节p H至7.4ʃ0.2㊂另将琼脂加入600m L蒸馏水中,煮沸溶解㊂将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2m L~4m L,高压灭菌121ħ10m i n或115ħ15m i n,灭菌后制成高层斜面,呈桔红色㊂A.8蛋白胨水㊁靛基质试剂A.8.1蛋白胨水蛋白胨(或胰蛋白胨)20.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000m L将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.8.2靛基质试剂A.8.2.1柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75m L戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25m L㊂A.8.2.2欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95m L95%乙醇内㊂然后缓慢加入浓盐酸20m L㊂A.8.3试验方法挑取小量培养物接种,在36ħʃ1ħ培养1d~2d,必要时可培养4d~5d㊂加入柯凡克试剂约0.5m L,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5m L,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色㊂注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸㊂每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用㊂A.9尿素琼脂(p H7.2)A.9.1成分蛋白胨1.0g氯化钠5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氢钾2.0g0.4%酚红3.0m L琼脂20.0g蒸馏水1000m L20%尿素溶液100m LA.9.2制法除尿素㊁琼脂和酚红外,将其他成分加入400m L蒸馏水中,煮沸溶解,调节p H至7.2ʃ0.2㊂另将琼脂加入600m L蒸馏水中,煮沸溶解㊂将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121ħ高压灭菌15m i n㊂冷至50ħ~55ħ,加。