载体及其上下游引物

实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。

2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。

【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。

PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。

现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。

引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。

引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。

这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。

常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。

引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。

过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

7、引物3’端不可修饰。

引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

载体名称上游引物（5'primer）下游引物（3'primer）P3*FLAG-CMV CMV-30(825-854)CMV-24(1129-1152)pAc5.1/V5-His(_A,_B,_C) pAc5-5 BGH revpAcG2T pGEX-5 not availablepACT T7EEV T3/EBVrevpACT2GAL4 ADfor pGAL4-ADrvpACT2p17110p12584pACYC184(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampACYCDuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1 pACYCDuet-1(MCSII) DuetUp2 T7-TerminatorpAdEasy-1 not available not availablepAdTrack-CMV not available not availablepAS2-1GAL4 Bdfor/P24990pGAL4-BDrv/P31430pB42AD pB42ADF PB42ADRpBABE pBMN_5'　pBacPAK8BAC1BAC2pBAD pBAD-F pBAD-RpBAD/HisABC pBAD-5'　pBBR1MCS T3/M13rev T7/M13forpBD-GAL4pBD-GAL4-F PBD-GAL4-RpBI12135S NOSpBIND GAL4-Bdfor T3,EBVrevpBK-CMV M13F/T7M13R/T3 pBluescriptIIKS(+/-) T3/M13rev T7/M13for（优先用M13F）pBluescriptIISK(+/-) T3/M13rev T7/M13for pBluescriptKS(+/-) T3/M13rev T7/M13for pBluescriptSK(+/-) T3/M13rev T7/M13forpBR322(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBR322(EcoRI/HindIII-sites) pBRforEco pBRrevHindpBR325(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBR329(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBridge(MCSI) GAL4-Bdfor3'BDpBridge(MCSII) not available not availablepBS-T II T3/M13rev T7/M13forpBS（AMP）T7T3pBSR T3T7terpBudCE4.1(MCSI) CMV-Profor,T7 c-mycrev,EBVrevpBudCE4.1(MCSII)EF-1α Fwd BGHpBudCE4.1/lacZ/CAT CMV-Profor,T7 c-mycrev,EBVrevpBV220pBV220F PBV220RpCAL-c T7/Tac-Profor T7-TerminatorpCAL-n T7/Tac-Profor T7-Terminator pCAMBIA1301(1300)pCAMBIA1301-5'(ECORI)/M13R pCAMBIA1301-3'(HindIII) pCAMBIA1304pCAMBIA1301-5'(ECORI)pCAMBIA1301-3'(HindIII) pCAMBIA2300M13R(-48)M13F(-47)/M13F(-49) pCANTB5E S1S6pCAT3-enhancer RVP3此载体无反向引物pCDFDuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1 pCDFDuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpcDNA1.1 CMV-Profor,T7 pCDM8-3pcDNA2.1 M13for/T7 M13rev/Tac-Profor pcDNA3 T7/CMV-Profor BGH rev/SP6pcDNA3.1(+/-) pcDNA3.1F/T7/CMV-Profor BGH revpcDNA3.1/His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH revpcDNA3.1/myc-His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH rev/c-mycrev pcDNA3.1/V5-His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH rev/V5revpcDNA3.1/Hygro(+,-) T7/CMV-Profor BGH rev/V5revpcDNA3.1/Zeo(+.-) T7BGHrevpcDNA3.3TOPOTA CMV-Profor TKPAreversepcDNA4/HisMax(_A,_B,_C) Xpressfor BGH revpcDNA4/HisMax-TOPO Xpressfor BGH revpcDNA4/HisMax-TOPO/lacZ Xpressfor BGH revpcDNA4/myc-His(_A,_B,_C)T7,CMV-Profor BGH rev,c-mycrev pcDNA4/TO TREfor/CMV-Profor BGH revpcDNA4/V5-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,V5revpcDNA4-TET/ON/AMP+CMV-Profor　pcDNA5/FRT T7/CMV-Profor BGH revpcDNA6/myc-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,c-mycrev pcDNA6/V5-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,V5revpCEP4pCEP-F/CMV-Profor EBVrevpCI T7（17BASE） EBVrevpCI-neo T7（17BASE） EBVrev,T3pCMS-EGFP T7 T3pCMS-EGFP T7 EBVrev,T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5pCMV5F PCMV5RpCMV6 CMV-Profor pCMV6-3、HGHrev pCMV6-XL4 CMV-Profor/T7 pCMV6-3、HGHrev pCMV-HA PCMV-F,CMV-Profor,TREfor PCMV-R，EBVrev pCMV-MYC(AMP+)PCMV-F PCMV-R, EBVrev pCMVmyc/nuc CMV-Profor BGH rev,c-mycrevpcmv-scriptEXVector T3 T7pCMV-Sport6 T7/M13for SP6/M13rev pCOLADuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1pCOLADuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpCR2.1 T7,M13for M13revpCR2.1-TOPO M13for,T7 M13revpCR3.1 T7 BGH revpCR3.1-Uni T7 BGH revpCR4 T3/M13rev T7/M13forpCR4-Blunt T3/M13rev T7/M13forpCR4-TOPO M13rev,T3 M13for,T7pCR-Blunt M13rev T7,M13forpCR-BluntII M13rev/SP6 T7/M13forpCR-BluntII-TOPO M13rev/SP6 M13for/T7pCRII M13rev/SP6 T7/M13forpCRII-TOPO M13rev/SP6 M13for/T7pCR-ScriptSK(+) T7/M13for T3/M13revpCR-XL-TOPO M13rev T7,M13forpCS2+(MCSI) SP6 EBVrev,T7?pCS2+(MCSII) T3 pSG5-3pDB_GAL4cam T7P　pDB_leu PDBLeu-5 PDBLeu-3pDEST22DEST22F DEST22RpDEST15 pGEX-5 T7-TerminatorpDEST20 pGEX-5 pFastBac-3pDEST26 TREfor/CMV-Profor T7/M13forpDisplay T7/CMV-Profor c-mycrevpDNR-LIB(MCS_A) M13for,T7 pSG5-3,M13RpDonar M13F M13RpDONR201PDONR-F PDONR-RpDONR207PDONR-F PDONR-RpDONR223M13F M13RpDrive T7/M13rev SP6/M13forpDsRED1-C1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRed1-N1 CMV-Profor RFP-Nrev,CMV-R? pDsRed2-N1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRed2-C1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRED2-C1(KAN+)pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDsRed-Express dsRed1_N_primer/CMV-F dsRed1_C_primer/CMV-R pDSRED-monomer-N1(KAN+)dsRed1_N_primer　pDSRED-N1(KAN+)pEGFP-N-5’ pDSRED-N-RpEASY-Blunt M13F T7/ M13RpEASY-BluntSimple M13F T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）pEASY-T1 Simple M13F M13R（距离插入位点合适，优先安排）pEASY-T1M13F/T7M13RpEASY-T3M13F/T7M13R/SP6pECFP-N(C)PECFP-N-5.PECFP-N-3,pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4,6/myc-His) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4,6/V5-His) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4;6/His_A;_B;_C) T7/Xpressfor Pcdna3.1R/BGH revpEF5/FRT/V5-D(-TOPO) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH rev pEGFP M13rev EGFP-NrevpEGFP-1 not available EGFP-Nrev/ PEGFP-N-3′pEGFP-C PEGFP-C-5′PEGFP-C-3′pEGFP-C1 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-C2 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-C3 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-F EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-N PEGFP-N-5′PEGFP-N-3′pEGFP-N1 CMV-Profor EGFP-NrevpEGFP-N2 CMV-Profor EGFP-NrevpEGFP-N3 CMV-Profor EGFP-NrevpENTR M13F M13RpET-11(-a,-b,-c,-d) T7 T7-TerminatorpET-12(-a,-b,-c) T7 T7-TerminatorpET-14b T7 T7-TerminatorpET-15b T7 T7-TerminatorpET-16b T7 T7-TerminatorpET-17b T7 T7-TerminatorpET-17xb T7 T7-TerminatorpET-19b T7 T7-TerminatorpET-20b(+) T7 T7-TerminatorpET-21(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-22b(+) T7 T7-TerminatorpET-23(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-24(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-25b(+) T7 T7-TerminatorpET-26b(+) T7 T7-TerminatorpET-27b(+) T7 T7-TerminatorpET-28a(-b,-c)(+) T7 T7-TerminatorpET-29a(-b,-c)(+)S.tag/T7 T7-TerminatorpET-3(-a,-b,-c,-d) T7 T7-TerminatorpET-30_Ek/LIC T7 T7-TerminatorpET-30_Xa/LIC T7 T7-TerminatorpET-30a(-b,-c)(+)S.tag/T7 T7-TerminatorpET-31b(+) not available T7-TerminatorpET-32_Ek/LIC TRXfor T7-Terminator pET-32_XA/LIC TRXfor T7-Terminator pET-32a(-b,-c)(+)S.tag/TRXfor T7-Terminator pET-33b(+) T7 T7-Terminator pET-34b(+)S.tag T7-Terminator pET-35b(+)S.tag T7-Terminator pET-36b(+)S.tag T7-Terminator pET-37b(+)S.tag T7-Terminator pET-38b(+) not available T7-Terminator pET-39b(+)S.tag T7-Terminator pET-40b(+)S.tag T7-Terminator pET-41_Ek/LIC GST-Cfor T7-Terminator pET-41a(-b,-c)(+) S.tag/pGEX-5 T7-Terminator pET-42a(-b,-c)(+)S.tag/pGEX-5 T7-Terminator pET-43.1a(-b,-c)(+)S.tag coliDOWNpET-43.1a_EK/LIC S.tag not availablepET-44a(-b,-c)(+)S.tag T7-Terminator pET-44a_EK/LIC S.tag not availablepET-45b(+) T7 T7-Terminator pET-46_Ek/LIC T7 T7-Terminator pET-5(-a,-b,-c) T7 T7-Terminator pET-52b(+) T7 T7-Terminator pET-7 T7 T7-Terminator pET-9(-a,-b,-c,-d) T7 T7-Terminator pETcoco-1 T7 T7-Terminator pETDuet-1(MCSI)pETUP1DuetDOWN1 pETDuet-1(MCSII)DuetUp2T7-Terminator pET-T4 T7 T7-Terminator pEYFP-C1pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEYFP-N1pEGFP-N-5’,CMV-Profor pEGFP-N-3’ pFLAG-ATS N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG-CTC N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG1N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG-CMV(-2)CMV-30；CMV-Profor CMV-24pFLAG-CMV1CMV-30CMV-24pGAD424GAL4_ADfor3'ADpGADGH GAL4_ADfor3'ADpGADT7T7/GAL4_ADfor3'ADpGADT7-Rec T7/GAL4_ADfor3'ADpGADT-T T73,BDpGAD10GAL4_ADfor3'ADpGAPZa-A a-FACTOR3'AOXpGBKT7T73,BDpGBT9MATCHMAKER5'DNA-BD/GAL4BD MATCHMAKER3'DNA-BDpGEM-1 T7 SP6pGEM-3 T7 SP6pGEM-3Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-4 T7 SP6pGEM-4Z T7/M13for SP6/M13rev pGEM-5Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-7Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-9Zf(+)(-) T7/M13for SP6/M13rev pGEM-T T7/M13for SP6/M13rev pGEM-T_Easy T7/M13for SP6/M13rev pGene/V5-His_A(_B,_C) pGENE-5 BGH rev,V5rev pGEX-2T pGEX-5 pGEX-3 pGEX-2TK pGEX-5 pGEX-3 pGEX-3X pGEX-5 pGEX-3 pGEX-4T-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3 pGEX-5X-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3 pGEX-6P-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3pGL2GLP1 GLP2pGL3RVP3GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2)pGL3-Basic(MCSI) RVP3(PGL3+)? GLP2(PGL3-)?pGL3-Basic(MCSII) RVP4, PLXSN-3'?pGL4 pGlow(-TOPO) T7 pGlow-3pGM-T T7SP6pGWC SP6T7pHook-2 T7/CMV-Profor not availablepIND/V5-His_A(_B,_C) not available BGH rev,V5rev PinpointTMVector PinpointPrimer SP6pIRES(MCSI) T7 pIRES-3pIRES(MCSII) not available T3,EBVrevpIRES2-EGFP CMV-Profor,pIRES2-EGFP.P5’ IRESrev,pIRES2-EGFP.P3’pIRES-hrGFP-2a CMV-Profor,T3 pIRES-hrGFP-3 pIRESneo2 T7/CMV-Profor pIRES-3pIVEX(all) T7/pBRrevBam T7-TerminatorpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpLNCX2CMV-Profor pRevTRE-3pLVTHM（H1启动子下游）H1primer SP6pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMALc MalE primer M13F(-47)pMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x Pmal-c2x-F(P5’)Pmal-C2X-R(P3’ ) pMALd MalE primer M13F(-47)pMALe MalE primer M13F(-47)pMAL-P4X MalE primer M13F(-47)pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)pMET A/B/C AUG1F AUG1RpMD18-T M13R(-48)ECORI M13F(-47)(HINDⅢ) pMD19-T M13F47M13R48pMD20-T M13F47M13R48 pMOSBlue T7/M13rev M13forpMSCV-puro pLXSNfw pMSCVrevpMT/V5-His_A(_B,_C) Mtfor BGH rev,V5rev pNTAP T3T7pCTAP pCTAP5'primer T7pOTB7 M13rev/T7 M13for/SP6 pOptiVEC-TOPO TA CMV-F/CMV-Profor EMCVIRES reverse pPC86PPC86-F PPC86-RpPC97PBD-GAL4-F PBD-GAL4-RpPIC3.5K5'AOX3'AOXpPic9k(A+,Z+)5’AOX(Ppic9k-f)/a-factor3’AOX(Ppic9k-R) pPICZa5'AOX/PPICZa-F3'AOX pPROEXHTA M13R(-48)无反向引物pProEX-HTa(b,c)M13R48/ Tac-Profor pBADrv/pTrcHis-3 pPD129.36　M13F20/M13FpQE30or40or60(AMP+)PQE30-F PQE-30RpRC/CMV2/CAT CMV/T7　pRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pRECEIVER-M03pRECEIVER-M03F pRECEIVER-M03R pREP4pREP4 forward primer EBV reverse primer pRK5 SP6 pSG5-3pRSET T7/Xpressfor T7terpRSFDuet-1(MCSI)DuetUP1DuetDOWN1 pRSFDuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpSecTac2 T7/CMV-Profor BGH rev/c-mycrev pSG5 pSG5-5,/T7PSG5-R(SV40) pSHlox1 T7 SP6pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSI T7 EBVrevpSilencer1.0-U6 T7 T3pSilencer2.0-U6 T7 M13forpSilencer2.1-U6neo T7 M13forpSilencer3.1-H1hygro M13F(-47) 3.0REVpSilencer4_1-CMVneo pSilener4.1-5' CMV-Profor pSILENCEV2.0-U6T7 2.0REVpSIneo T7 EBVrev,T3Psit T7 T7TpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+)T7 T3pSOS Psos5'Psos3'pSP64 SP6 M13revpSP64/65SP6 此载体无反向引物pSP65 SP6 M13revpSP70 SP6 T7pSP71 SP6 T7pSP72 SP6 T7pSP73 SP6 T7pSport1SP6/M13F(-47)T7/M13R pSPORT1 SP6/M13for T7/M13revpSPT18 SP6 T7pSTBlue T7/M13rev SP6/M13for pSUPER.Basic T7/M13F M13RpSUPER T7T3pSURE-T M13F M13RpSURE-Tsimple M13F-47M13R-48 pSuperCos pBRforEco T7pT3T7 M13rev/T3 M13for/T7pT7-7 T7 not availablepT7Blue®T7 M13F(-47)pT7T3_18U M13rev/T7 M13for/T3pT7T3D-PAC M13rev/T7 M13for/T3pTA2M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13rev T7,M13forpTAg T7/M13rev M13for pTARGETTM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.RpTG19-T M13F(-47)M13R(-48) pTARGETTM T7/M13F PTARGET-SEQ pThioHisA,B,andC Trx Forward Trx Reverse / M13for pTO-T7T7 T7TERpTRC99A PTRC99A-F pTrcHis-rvpTrc99a-c PTRC99C-F PTRC99C-RpTRC99a-c PTRC99C-F PTRC99C-R pTrcHisB PTrcHisA-F/Xpressfor PTrcHisA-R pTrcHisA PTrcHisA-F PTrcHisA-RpT-REX-DEST30 TREfor T7pTriEx1 T7/TriExup TriExdownpTriEx1.1 T7/TriExup TriExdownpTriEx1.1_Hygro T7/TriExup not availablepTriEx1.1_Neo T7/TriExup IRESrevpTriplEX1 TriplEx-LD-5 T7,TriplEx-LD-3pTriplEX2 TriplEx-LD-5；pTR5‘ T7,TriplEx-LD-3pTWIN-1T7 T7TERpTXB1 T7 MxeInteinrevpTXB2 T7 MxeInteinrevpTXB3 T7 MxeInteinrevpTYB1 T7 InteinrevpTYB2 T7 InteinrevpTYB3 T7 InteinrevpTYB4 T7 InteinrevpTZ_18U T7/M13rev M13forpUB6/V5-His UB-F BGH rev,V5revpUC13 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC18 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC18(19)/118(119)M13F(-47)M13R(-48)/PUC19(HINDⅢ) pUC19 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC57 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC8 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC9 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUM-T M13F(-20)M13R(-20)pUCm-T(AMP+)M13F/T7M13RpUNI/V5-His not available BGH rev,V5revpVAX1T7 T7/CMV-Profor PCDNA3.1R/BGHRpVP22/mycHis VP22-Cfor BGH rev,c-mycrevpVP22/mycHis2 T7/CMV-Profor VP22-NrevpWE15 pBRrevHind T7pYES2 T7pYes2.RpYES-DEST52 T7/GAL1-Profor V5rev/CYC1-Terminator pYEX_4T_1 Clontech pYEX_4T-3pYEX_4T_2 pGEX-5 pYEX_4T-4pYEX_4T_3 pGEX-5 pYEX_4T-4pYEX_4T_4 pGEX-5 pYEX_4T-4pZeoSV2+/hu-Tyr T7 not availablepZERO-1 M13rev/SP6 T7/M13forpZERO-2 M13rev/SP6 M13for/T7pZome-1-C Zome-F Zome-RpZome-1-N Zome-F Zome-RYCp50(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYEp13(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYEp24(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYIp5(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBam RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-U6ZsGreen U6　菌PCDB T7BGH天为时代TA载体T7T3m13（+）T7？T3？pMSCV-neo pMSCV-5'pMSCV-3'。

mi 引物设计原则1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是18-27 bp,但不应大于38,由于过长会导致其延长温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进展反响。

2、引物序列在模板内应当没有相像性较高,尤其就是3’端相像性较高得序列,否则简洁导致错配。

引物3’端消灭 3 个以上得连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。

3、引物3’端得末位碱基对Taq 酶得DNA 合成效率有较大得影响。

不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为 A 得错配效率明显高于其她 3 个碱基,因此应当避开在引物得3’端使用碱基A。

另外,引物二聚体或发夹构造也可能导致PCR 反响失败。

5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。

4、引物序列得GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反响。

上下游引物得GC 含量不能相差太大。

5、引物所对应模板位置序列得Tm 值在72℃左右可使复性条件最正确。

Tm 值得计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo 软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6、ΔG值就是指DNA 双链形成所需得自由能,该值反映了双链构造内部碱基对得相对稳定性。

应中选用3’端ΔG值较低(确定值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高得引物。

引物得3’端得ΔG值过高,简洁在错配位点形成双链构造并引发DNA 聚合反响。

7、引物二聚体及发夹构造得能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反响不能正常进展。

8、对引物得修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应依据下一步试验中要插入PCR 产物得载体得相应序列而确定。

引物序列应当都就是写成5-3 方向得,Tm 之间得差异最好掌握在1 度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp 左右。

引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。

本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。

一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。

一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。

1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。

2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。

同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。

3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。

引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。

4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。

过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。

通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。

二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。

载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。

1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。

常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。

根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。

2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。

通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。

3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。

连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。

4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。

总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。