离子交换层析技术
层析( chromatography) 也称为色谱, 就是将混合物中各种组分分离的方法, 是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相, 即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时, 由于各组分在两相之间的分配比例不同, 它们( 各组分) 就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相能够是固体, 也能够是被固体或凝胶所支持的液体。定相能够被装入柱中或涂成薄层、薄膜, 成为层析”床”。动相能够是气体, 也能够是液体, 前者称为气相层析, 或者成为液相层析。
离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相, 以待分离的样品为移动相, 分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
( 一) 原理
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团, 当结合阳离子基团时, 可换出阴离子, 则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基( Dicthylaminoethyl, DEAE) 纤维素。在纤维素上结合了DEAE, 含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H, 它的反离子为阴离子( 如Cl-等) , 可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时, 可置换阳离子, 称为阳离子交换剂, 如羧甲基( Carboxymethy, CM) 纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子( 纤维素－O－CH2－COO一) , 其反离子为阳离子( 如Na+等) ,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时, 静电荷为0, 当溶液pH值大于蛋白质等电点时, 则羧基游离, 蛋白质带负电荷。反之, 溶液的pH值小于蛋白质等电点时, 则氨基电离, 蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远,
蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷, 但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异, 以白蛋白为最多, 依次为α球蛋白, β球蛋白和γ球蛋白。
在适当的盐浓度下, 溶液的pH值高于等电点时, 蛋白质被阴离子交换剂所吸附; 当溶液的pH值低于等电点时, 蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同, 只要溶液pH值发生改变, 就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附, 从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
交换剂对胶体离子( 如蛋白质) 和无机盐离子( 如NaCl) 都具有交换吸附的能力, 当两者同时存在于一个层析过程中, 则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时, 蛋白质不容易被吸附, 吸附后也易于被洗脱, 当Cl-浓度小时, 蛋白质易被吸附, 吸附后也不容易被洗脱。因此, 在离子交换层析中, 一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度, 一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时, 抑制蛋白质阳离子化, 随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时, 抑制蛋白质阴离子化, 随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时, 增加盐离子, 则降低pH值。当使用阳离子交换剂时, 增加盐离子浓度, 则升高溶液pH值。
( 二) 常见离子交换剂的种类与特性
1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多, 其种类与特性如表1－1所示。
表1-1 离子交换剂的类型与特点
在交换纤维素中, 最常见的是DEAE纤维素和CM纤维素。由于剂型不同, 其理化性质和作用也有所差异。一般而言, 微粒型要优于纤维素型, 因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大, 粒细、比重大, 能装成紧密的层析柱, 要求分辨力高的实验可用此型纤维素( 见表1－2) 。
表1-2 商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性
离子交换纤维素的优点为: ①离子交换纤维素为开放性长链, 具有较大的表面积, 吸附容量最大; ②离子基团少, 排列稀疏, 与蛋白质结合不太牢固, 易于洗脱; ③具有良好的稳定性, 洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂, 它与离子交换纤维素不同点是载体不同, 常见交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。
表1-3 常见交联葡聚糖的类型与特性
离子交换交联葡聚糖有如下优点: ①不会引起被分离物质的变性或失活;
②非特异性吸附少; ③交换容量大。
离子交换葡聚糖的选用, 一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量( 30 000-200 000) 一般选A50和C50, 而低分子量( ＜30 000和高分子量＞200 000) 均宜选用A25和C25。
( 三) 试验方法
阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖
的预处理只需充分溶胀和平衡, 不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其它步骤也基本同离子交换纤维素。
1．剂型的选择根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择, 如pH高于蛋白质等电点, 应选阴离子交换剂, 反之应选阳离子交换剂。一般情况下, DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白, 而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以DEAE-纤维素操作为例, 介绍试验方法
2．膨胀活化此步的目的在于除去杂质, 暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。
表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其它条件的大致关系
称取所需的量, 撒于0.5Mol/L NaOH溶液中( 1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液) , 浸泡1h左右, 不时搅拌。抽滤( 以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤) , 以蒸馏水洗涤, 再抽滤, 直至滤液近中性为止, 再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h, 同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH 液中, 同样处理, 洗至中性。
3．平衡将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中( 即起始缓冲液) , 静止1h, 不时搅拌, 待纤维素下沉后, 倾去上清液或抽滤除去洗液, 如此重复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4．装柱层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言, 柱长和柱直径之
