8.1-2 凝胶色谱与离子交换色谱

离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。

即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。

带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。

二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。

对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。

对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。

如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。

如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。

对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。

离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。

阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。

由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。

两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。

column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。

d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。

例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。

近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。

亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。

肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。

e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。

如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。

同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。

四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。

化学分离技术中的离子交换色谱离子交换色谱是一种常用的化学分离技术，广泛应用于生化、药物、食品、环境等领域。

在化学实验室和工业生产中，离子交换色谱是一个必不可少的工具。

离子交换色谱的原理是利用离子交换树脂与样品中离子的相互作用，将不同离子分离开来。

离子交换树脂是一种高分子材料，具有很强的离子交换能力，可以选择性地吸附或释放离子。

当样品溶液通过离子交换柱时，离子与离子交换树脂表面上的离子发生竞争作用，最终被吸附在离子交换树脂上，从而实现分离。

离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两种类型。

在阳离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阴离子，可以选择性地吸附阳离子；在阴离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阳离子，可以选择性地吸附阴离子。

离子交换色谱在化学分离中的应用非常广泛。

例如，在食品分析中，离子交换色谱可以用于检测大豆制品中的异黄酮；在生化分析中，离子交换色谱可以用于检测DNA和蛋白质；在药物制剂中，离子交换色谱可以用于纯化生物碱和抗生素。

离子交换色谱不仅可以用于分离和检测化学物质，还可以用于污水处理和工业废弃物处理。

例如，农业废水中的氨氮可以通过阴离子交换色谱沉淀出来，从而减少对环境的污染。

然而，离子交换色谱在使用时也存在一些问题。

首先，离子交换树脂会受到样品中其他成分的影响而失活，从而影响分离的效果。

其次，离子交换色谱在使用过程中需要经常更换离子交换柱，增加使用成本。

此外，离子交换色谱需要进行缓冲液的调配和pH值的控制，操作较为繁琐。

总之，离子交换色谱是一种非常有用的化学分离技术，具有广泛的应用前景。

虽然存在一些问题，但随着科技的发展和技术的改进，离子交换色谱将会被更广泛地应用于各个领域，为化学分离技术做出更大的贡献。

离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。

该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。

本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。

一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。

离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。

根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。

二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。

2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。

3、将样品溶液注入进样器中。

4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。

5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。

6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。

三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。

通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。

通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。

3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。

通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。

4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。

离子交换层析、凝胶色谱、离子交换纤维素色谱法(2009-07-16 09:26:05)转载▼分类：生物专业标签：杂谈对3者进行了细心总结离子交换层析（ion exchange chromatography）离子交换层析（简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。

本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。

50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。

目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

因为蛋白质分子在PH高于其等电点的溶液中-COOH会部分解离释放质子从而带负电。

蛋白质带有负电荷时叫做阴离子交换，蛋白质带有正电荷时叫做阳离子交换。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换层析法分离氨基酸原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸(pI2.77)、碱性氨基酸(pI7.59)，用强酸型阳离子交换树脂Dowex50，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。

利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定1、层析：将Dowex50装柱后，用0.1mol/L NaOH清洗树脂5分钟。

离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography，简称IEX）是一种在离子交换树脂上进行的分离技术。

该技术基于样品中离子与固相固定离子之间的相互作用，实现样品中化合物的分离和纯化。

离子交换色谱的原理是利用带电的离子交换树脂作为固定相，当样品溶液经过固定相时，离子交换树脂上的固定离子会与样品中的带电离子发生相互作用。

在交换树脂上，样品中的带电离子可以与固定离子发生相互作用，形成离子交换。

通过调节溶液的离子强度或改变pH值，可以控制离子交换的强弱，从而实现对样品中的离子的分离。

离子交换色谱技术广泛应用于生物化学、生命科学、制药和环境科学等领域，常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物分子。

同时，离子交换色谱也可以用于分析和测定样品中特定离子的浓度。

离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，简称CEX）和阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，简称AEX）
两种类型。

阳离子交换色谱适用于带正电荷的物质的分离，而阴离子交换色谱则适用于带负电荷的物质的分离。

第七节离子交换色谱离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。

20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。

但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。

20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。

其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。

此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。

一、离子交换色谱相关理论(一)基本原理离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。

离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。

图6.7-1 离子交换色谱原理梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子；待分离的目标分子；▲需除去的杂质1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平衡色谱柱，以备下次使用蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。

常用的色谱方法（吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱）(3) (二)凝胶凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体颗粒状物质，其内部都具有很微细的多孔网状结构。

目前市场上供应的色谱用凝胶主要有交联葡凝聚糖、交联聚丙稀酰胺以及琼脂糖等。

交联葡聚糖，瑞典出品商品名称为Sephadex，国产商品名称为Dextran，它是由葡聚糖(右旋糖苷)和甘油通过醚桥(—O—CH2—CHOH—CH2—O—)相交联而成的多孔性网状结构，制备葡聚糖凝胶所用的交联剂为3氯-1. 2—环氧丙烷()由于交联度的不同，Sephadex颗粒孔隙大小也不同，按交联程度大小，Sephadex可以分成不同的型号，交联度大的孔隙小吸水少，膨胀也少，用于小分子量物质的分离，交联度小的孔隙大吸水多，膨胀也大，适用于大分子物质的分离。

交联度可用“吸水量”表示，即每克干凝胶所吸收的水份重量，用这个量比较交联度的大小。

商品凝胶的型号采用“吸水量”(水容值)的10倍数字来表示。

例如每克凝胶吸水量为2.5克即定为G—25型，见表2-2。

表2—2葡聚糖凝胶（G）类的技术数据型号分离范围（分子量）吸水量克/克干凝胶膨胀体积毫升/克干凝胶浸泡时间（小时）蛋白质多糖20~25℃90~100℃G—10<700<7001.0±0.12~331G—15<1500<15001.5±0.22.5~3.531G—25 1000~5000 100~5000 2.5±0.24~631G—50 1500~30000 500~10000 5.0±0.39~1131G—753000~70000 1000~50000 7.5±0.512~15243G—1004000~150,000 1000~100,000 10±1.015~20725G—1505000~400,000 1,000~150,000 15±1.520~30725G—2005000~800,0001000~200,00020±2.030~40725(三)凝胶色谱的特点及其应用：凝胶色谱与其它色谱比较具有以下特点：(1)由于凝胶色谱是按分子大小不同而分离，洗脱剂种类不影响洗脱效果，所以可以保证在温和条件下洗脱，不会引起生物物质的变性失活；(2)凝胶色谱中无需改变洗脱液成分或种类。