Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明

Westernblot试剂配制及操作流程Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（，）1%NP40%TritonX-100%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%⽢油调pH值⾄。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使⽤时，加⼊蛋⽩酶抑制剂cooktail。

制胶⽤（1-6）：1.L Tris·HCl （）Tris 12.114g蒸馏⽔ 100ml溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。

2.L Tris·HCl（）Tris 18.671g蒸馏⽔ 100ml溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。

3.10％SDSSDS 10g蒸馏⽔⾄ 100ml如溶解困难，可在50℃⽔浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，⽔浴溶化后，仍可使⽤。

4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺蒸馏⽔ 1ml（现⽤现配，可先将过硫酸胺⼲粉称好分量后放在管中，⼀次性多装⼏管，使⽤时加⼊蒸馏⽔⽔即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基⼄⼆胺原液（TEMED）： 4?C保存。

6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。

10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据⾃⼰所做蛋⽩的⼤⼩确定依次加⼊去离⼦⽔30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（）10%SDS 150µl10%AP 150µlTEMED 6µl每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。

灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加⼊去离⼦⽔30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（）10%SDS 60µl10%AP 60µlTEMED 6µl每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。

Western及IP细胞裂解液产品简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，譬如Triton、SDS、NP-40等。

Western及IP 细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。

所获得的蛋白质可以用于SDS-PAGE，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris、Triton X-100组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得的样本的蛋白浓度。

产品组成：主要成分：主要由 Tris-HCl、NaCl、Triton X-100，以及sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。

自备材料：1、高速离心机2、微量移液器3、PMSF，亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011)操作步骤（仅供参考）：(一)贴壁培养细胞1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每1孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。

移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。

4、10000～12000g，离心3～5min（如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳），取上清。

蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南目录目录 (1)一、总蛋白的提取 (2)1 试验类型和蛋白类型 (2)2 样品组织类型 (3)3 蛋白表达峰度判断 (4)4 总蛋白提取的基本步骤 (4)4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 (5)4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 (5)二、总蛋白BCA定量 (6)三、SDS-PAGE凝胶电泳 (7)四、转膜 (8)五、信号增强剂处理膜 (9)六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 (9)1 封闭 (9)2 一抗孵育 (9)3 二抗孵育 (13)七、曝光显色 (14)八、灰度分析 (15)九、抗体及相关溶液配制 (15)1 抗体 (17)2 相关溶液配制表 (17)蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。

Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。

虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。

其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。

很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。

抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。

你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。

我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明货号：LS00160规格：100mL保存：-20℃保存，12个月。

产品说明：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。

所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate等组成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制剂，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。

操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁培养细胞1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入100～200µL裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。

移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。

4、10000～12000g，离心3～5min(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。

蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南目录目录 (1)一、总蛋白的提取 (2)1 试验类型和蛋白类型 (2)2 样品组织类型 (3)3 蛋白表达峰度判断 (4)4 总蛋白提取的基本步骤 (4)4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 (5)4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 (5)二、总蛋白BCA定量 (6)三、SDS-PAGE凝胶电泳 (7)四、转膜 (8)五、信号增强剂处理膜 (9)六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 (9)1 封闭 (9)2 一抗孵育 (9)3 二抗孵育 (13)七、曝光显色 (14)八、灰度分析 (15)九、抗体及相关溶液配制 (15)1 抗体 (17)2 相关溶液配制表 (17)蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。

Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。

虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。

其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。

很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。

抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。

你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。

我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。

Western 及IP 细胞裂解液简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton 、SDS 、NP-40等。

Western 及IP 细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。

Leagene Western 及IP 细胞裂解液得到的蛋白，可以用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford 法测定由Western 及IP 细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁培养细胞1、 取Western 及IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、 去除贴壁细胞的培养液，低速离心，弃上清。

3、 按照6孔板每孔加入100～200μl 含有PMSF 的裂解液的比例。

通常裂解液作用于细胞1～5s 内，细胞就会被裂解。

4、 离心(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。

5、 进行后续的SDS-PAGE 、Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞1、 取Western 及IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、 低速离心悬浮细胞，弃上清。

3、 用手指轻弹细胞，使其松散。

按照6孔板每孔细胞加入100～200μl 含有PMSF 的裂解液的比例，加入Western 及IP 细胞裂解液。

4、 4℃离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、 进行后续的PAGE 、Western 、免疫沉淀等操作。

(三)组织样本1、 取Western 及IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3、 取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

编号 名称 PS0009 Storage Western 及IP 细胞裂解液 100ml -20℃ PMSF(100mM) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份4、按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例。

RIPA裂解液(强)产品简介：碧云天生产的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。

RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。

RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。

RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。

关于不同的RIPA裂解液以及碧云天生产的其它裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液可参考我们的相关网页：/lysis-buffer.htm 。

RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris (pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。

可以有效抑制蛋白降解。

用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/ P0012S)测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

保存条件：-20℃保存，一年有效。

注意事项：为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。

可以适当分装后使用。

需自备PMSF。

PMSF(ST506)可以向碧云天订购。

裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

关于裂解液的选择，一方面可以参考碧云天的相关网页：/lysis-buffer.htm 选择合适的裂解液；另一方面也需要通过一些预实验来摸索最佳的适合您实验条件的裂解液。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：对于培养细胞样品：1.融解RIPA裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

Western 及IP 细胞裂解液简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton 、SDS 、NP-40等。

Western 及IP 细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。

所获得的蛋白质可以用于PAGE 电泳，Western ，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl 、NaCl 、低浓度Triton X-100， 低浓度sodium pyrophosphate 等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Leagene Western 及IP 细胞裂解液得到的蛋白，可以用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford 法测定由Western 及IP 细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁培养细胞1、 取Western 及IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF ，使PMSF 终浓度。

2、 去除贴壁细胞的培养液，用PBS 、NS 或无血清培养液清洗，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、 每孔加入含有PMSF 的裂解液的比例，加入Western 及IP 细胞裂解液。

移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液作用于细胞1～5s 内，细胞就会被裂解。

4、 离心 (如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。

5、 进行后续的SDS-PAGE 、Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞1、 取Western 及IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF ，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、 用手指轻弹细胞，使其松散。

按照6孔板每孔细胞加入含有PMSF 的裂解液的比例，加入Western 及IP 细胞裂解液。

Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。

冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。

（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。

以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。

Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。

Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14）71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。

Beyotime Biotechnology400-1683301800-8283301e-mail***********************************Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)产品简介：Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)，是一种在非变性条件下裂解细胞或组织样品从而制备蛋白样品的裂解液。

本细胞裂解液裂解的细胞或组织样品，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)，免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等，以及许多兼容1% Triton X-100的酶活性或者生物小分子的检测。

使用本裂解液时，用户可以根据具体用途自行添加特定抑制剂或者不添加抑制剂。

本产品可以用于动物、植物的细胞或组织样品，也可以用于真菌或细菌样品。

碧云天生产的不同裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液可参考我们的网页：/support/lysis-buffer.htm。

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)的主要成分为20mM Tris (pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，不含蛋白酶、磷酸酯酶等抑制剂。

在添加蛋白酶抑制剂的情况下，可以有效维持原有的蛋白间相互作用。

使用本裂解液获得的蛋白样品，如果用于酶活性检测或一些生物小分子的检测，需要测试标准品用本裂解液稀释后是否会显著影响标准曲线。

如果本裂解液对于标准曲线无显著影响，则可以使用本裂解液。

用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/ P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

westernblot操作规范Weternblot操作流程1.样品的准备a收集蛋白样品(Proteinamplepreparation)可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用相应的蛋白抽提试剂盒进行抽提。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用碧云天生产的Wetern 及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

b样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-蛋白上样缓冲液。

例如2某或5某的SDS-蛋白上样缓冲液。

使用5某的SDS-蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5某的SDS-蛋白上样缓冲液的配置100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

如果不立即电泳，样品可放置于-20℃或者-80℃保存。

2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-)a准备SDS-凝胶[1].按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。

(注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗一遍，晾干)[2].装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。

[3].根据表1确定凝胶浓度体积，按表3配制分离胶溶液。

按表中成分顺序加入烧杯配制。

[4].小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到足够高度。

注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1cm。

）。

[5].轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。

[6].凝胶充分聚合。

时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。

[7].倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。

PH0406|Western及IP细胞裂解液Cell Lysis Buffer for Western and IPCatalog No：PH0406Size：☐100mL Store at-20℃试剂简介Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。

本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)。

Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1%Triton X-100，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5ug/ml leupeptin等多种抑制剂。

可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

试剂组分Western及IP细胞裂解液----100mL----Store at-20℃PMSF(100mM)----1.5mL----Store at-20℃试剂保存：-20℃保存，12个月有效。

使用参考（仅供参考）对于培养细胞样品：(一)贴壁培养细胞1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。

Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。

冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。

（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。

以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。