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漆酶活性测定方法本页仅作为文档页封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March一、测 O法2漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有O z 的介入。
测量反应的耗氧量既可间接地推知漆酶的活性。
较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一原理。
这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将 1个漆酶活性单位定义为PH6 ． o 及2 5 ℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时所需要的酶量。
亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶消耗1. 0 μmo lO2的活性。
郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。
即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量，同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律及漆酶促吸氧的克分子比。
此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l 在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒 [ 2 1 。
漆树酶活力检测用0..1m ol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10 m ol·L-1。
分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3 μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的化反应的初速度，单位记为△A350mm比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212 漆酶活性的定量测定方法21211 分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495) 、愈创木酚(λmax 485) 、邻苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力测定的底物。
纤维素酶—木聚糖酶—漆酶的共固定化纤维素酶、木聚糖酶和漆酶是植物细胞壁复式结构中重要的3种酶，也是降解该复式结构和合成植物细胞壁相关糖苷键的关键因素。
它们可以帮助植物细胞壁的强度和分解，从而分解产生植物细胞壁的原料。
共固定化技术可以有效的运用于三种类型的酶，利用这种技术可以高效的将三种酶共同固定在一个可随机分离的载体上，使它们能够有效的作用在一个催化体系中，从而使整个催化体系的性能得到提高。
在利用这种技术进行共固定化之前，需要先了解三种酶的特性及其作用。
纤维素酶是一种降解纤维素和半纤维素的酶。
它能够将纤维素类物质分解成糖原和半乳糖，也就是说，它能够将纤维素分解成更小的片段，从而更容易被植物细胞吸收利用。
木聚糖酶是一种能够降解木聚糖的酶，木聚糖是植物细胞壁中最重要的成分之一，由它和纤维素组成植物细胞壁的复式结构。
因此，木聚糖酶可以帮助植物细胞壁分解，使它们能够更有效的利用木聚糖。
漆酶是一种能够降解漆素的酶，漆素是植物细胞壁的一种重要成分，它可以使植物细胞壁表面的分子间的结合较为牢固，这样植物细胞壁才能够较为牢固地被细胞吸收，而漆素也能够减少植物细胞壁的渗漏性，从而保护细胞的稳定性。
共固定化技术可以有效的利用纤维素酶、木聚糖酶和漆酶的作用，将它们共同固定在一个可随机分离的载体上，从而使它们能够有效高效的催化单一催化体系中的反应。
这种方法可以有效的利用三种酶的联合作用，从而有效的将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解，也可以通过利用植物细胞壁复式结构中的糖苷键反应来合成新的有机物，从而实现植物细胞壁复式结构的合成和分解。
此外，使用共固定化技术的另一个优势是能够更有效的利用酶的活性。
共固定化可以有效的将三种酶以较高的活性结合在一起，从而提高整个催化体系的性能，更有效的利用酶的活性，从而将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解和合成。
此外，共固定化技术还具有一定的可操作性、可组装性特征，可以根据需要将多种酶混合，可以控制混合酶的比例，进行更加精确的操作，从而更好的利用混合酶的作用，节约成本，提高混合酶的性能。
漆酶性质及应用漆酶(1accase)是一种含铜的多酚氧化酶，通常由500个氨基酸单一多肽组成,其中含有19种氨基酸，漆酶有一定的含糖量[1]。
真菌漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu2+三个部分组成，分子量在60-390kDa之间[2]。
肽链一般由500-550个氨基酸组成[3]，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10%-80%。
糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因。
漆酶一般含有4个铜离子(P. radiate漆酶除外,仅含2个铜离子,无3号铜离子)。
根据其光谱特征,可划分为3种类型的铜: 1号铜(只有一个铜离子,顺磁性)具有典型的蓝铜谱带:紫外可见光谱上600nm [ε: 5000 (mol·L-1cm)-1]处出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有一个小的平行超精细耦合结构[A11:(4070) * 10-4cm-1],它参与分子内的电子传递,把电子从底物传递到其他铜原子上; 2号铜(只有一个铜离子,顺磁性)只具一般的EPR谱带(A11>140×10-4m-1); 3号铜由2个3号铜原子通过一个OH桥配位连接起来,组成双核铜区,具有抗磁性,因而在EPR上无谱带,紫外可见光谱上330nm处的肩峰是3号Cu2+的特征峰。
漆酶空间结构更详细的资料来自其晶体衍射的研究。
含四个铜原子的酶分子是常见的形式,而某些酶蛋白的辅基有例外的情况。
Karhunen E[4]等的研究指出,phlebia radiata产生的漆酶中只含有2个铜原子，另外还有一分子的有机小分子辅基吡咯喹琳醌(pyrroloquinolin-equi-none, PQQ),该辅基在分子中扮演类似Ⅲ型铜原子的功能。
漆酶能够催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水，属于铜蓝氧化酶(或称为铜蓝蛋白酶)中的一小族，广泛存在于真菌、植物和昆虫中，有报道细菌也能产生漆酶I21。
产漆酶真菌以及漆酶的研究摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在细菌、真菌、放线菌、植物中都有报道，但报道最多的为真菌，尤其是白腐真菌。
漆酶能够降解环境中的木质素，在纸浆漂白、废水处理中意义重大。
漆酶通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，通过电子在这四个铜原子间相互传递达到分解底物的目的。
漆酶基因的异源表达已经吸引了广大学者的目光，至今为止，数十种真菌的漆酶基因已经成功在酵母等异源表达系统中表达，我们可以预见漆酶在人类未来的生活中将发挥重要作用。
关键词：漆酶，白腐真菌，铜原子结合，异源表达现如今，环境污染已严重影响了人类的生存，造纸厂、纺织厂排出的废水则是重要的污染源之一。
木质素是使废水颜色发黑的主要原因[1]，倘若在工厂排出废水前先将木质素出去，将会大大降低废水的毒性。
木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，是世界上仅次于纤维素的第二位最丰富的有机物。
木质素作为纤维素的粘合剂，能增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。
木质素外观上是一种白色或接近无色的物质，相对密度大约在1.35~1.50 之间，非常坚硬，难溶于各种无机或有机溶剂[2]。
木质素属天然芳香族高分子聚合物，是一类在自然界存在量很大但是又较难降解的可再生资源，木质素不含易水解的重复单元，因而不受水解酶的攻击，不仅如此，它还和半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使纤维素酶不易与纤维素分子接触，给纤维素的降解也造成了困难[3]。
因此去木质素成为目前人们面临的一大难题。
1 白腐真菌降解木质素研究表明，在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果。
其中，真菌起主导作用[4]，某些真菌能够有效的降解木质素，尤其是白腐真菌（white-rot fungus）可通过一系列的酶促反应实现对木质素的彻底降解。
白腐真菌是一类丝状真菌，分类学上属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。
漆酶的结构与催化反应机理漆酶是天然漆主要成分之一，含量约为10%。
存在于天然漆的含氮物质中，俗称生漆蛋白质、氧化酶。
是天然漆在常温下干燥时不可缺少的天然有机催化剂。
不溶于水，也不溶于通用有机溶剂，而溶于漆酚。
含氮物质接触乙醇后，能不可逆地从生漆中析出。
漆酶是一种氧化酶(能与分子氧起作用)，而不是过氧化酶，漆酶能受HCN的影响，而过氧化酶则不受其影响。
漆酶可促进多羟基酚及多氨基苯的氧化，而不能促进单酚的氧化。
因漆酶的催化氧化作用，可以促进漆酚的氧化聚合，从而形成干固的膜。
漆酶对下述物质敏感：过氧化氢、氢氰酸、羟胺、硫化氢、氰化钾、重氮化钾(或钠)等。
漆酶在其他植物(土豆、蘑菇、苹果)中也有发现。
结构[2]典型的漆酶有三个结构域，其中T1铜离子位于结构域3、三铜离子中心位于结构域1和结构域3之间，此外还有结构域2，主要起联结作用以及与底物的结合作用。
但也有报道发现仅存在两个结构域（结构域1和结构域3）的漆酶蛋白，并且该蛋白质展现出较高的pH 稳定性和漆酶的其它氧化还原特性。
人们习惯上称蓝铜为T1铜离子，这个铜离子是人们通过光谱学的手段最早发现的铜离子。
T1位点的几何结构与普通的金属蛋白铜位点的几何结构有所不同，它是一个扭曲的四面体，通过半胱氨酸形成一个S－Cu健，此外还有两个组氨酸（HiS）的N原子以及甲硫氨酸的S原子成健。
催化氧化机理[2]漆酶的催化氧化是非常复杂的。
一方面，由于漆酶同过氧化酶和其它多酚氧化之间作用底物的相似性，比如现在经常被用作真菌漆酶的特征底物的丁香醛连氮和ABTS(2 ，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))，但是实际上过氧化酶也能够催化氧化它们；不过相对这些酶来说，漆酶反应过程中并不产生有害的过氧化氢和活性氧(ROS)，但同时产生醌或半醌等强抗氧化剂，是非常绿色的反应。
许多报道为漆酶催化氧化的反应，经常缺乏进行它们之间有区别的实验报道。
不过，现在已经有一些学者注意到了这个问题的复杂性。
过氧化氢与漆酶的协同催化反应今天咱们来聊一个特别有趣的事儿，就像两个小伙伴一起合作完成一件超级厉害的任务一样，这个事儿就是过氧化氢和漆酶的协同催化反应。
咱们先来说说漆酶吧。
漆酶呀，就像是一个小小的魔法精灵。
它住在一些特别的地方，比如说在一些植物或者微生物的小世界里。
想象一下，漆酶就像一个勤劳的小工匠，它特别擅长改变一些东西的模样。
比如说，它可以对那些颜色呀，还有物质的结构做一些很有趣的调整。
那过氧化氢呢？过氧化氢就像是一个活力满满的小助手。
它自己就带着一种特殊的能量，就像我们小朋友充满活力地跑来跑去一样。
当漆酶和过氧化氢碰到一起的时候，就像是两个好朋友一拍即合，开始了一场奇妙的合作之旅。
它们会让很多我们看起来普普通通的东西发生意想不到的变化。
给你们讲个小例子吧。
就好比我们有一堆彩色的小珠子，这些小珠子单独放在那里的时候，就是普普通通的样子。
可是当漆酶和过氧化氢这两个小伙伴开始工作的时候，就像有一双神奇的手在摆弄这些小珠子，这些小珠子的颜色可能会变得更加鲜艳，排列的方式也会变得很不一样。
再比如说，我们把一片有点发黄的树叶想象成那些需要改变的物质。
漆酶和过氧化氢就像两个小小的魔法师，它们来到这片树叶旁边。
过氧化氢先释放出自己的能量，就像给树叶注入了一股活力。
然后漆酶就开始施展它的魔法，慢慢地，这片树叶好像重新焕发了生机，原本暗淡的颜色变得好看了起来。
这种协同催化反应在我们的生活里也很有用呢。
比如说在处理一些污染的时候。
就像我们的小花园里有一些脏东西，这些脏东西让小花园看起来不那么美丽了。
漆酶和过氧化氢就可以像清洁小卫士一样，它们一起努力，把那些脏东西变成没有危害的东西，让小花园又变得干干净净，花朵可以快乐地生长，小蝴蝶也能开心地飞来飞去。
还有在做一些手工艺术品的时候。
我们想要让我们的作品有一些特别的效果，就可以利用这个奇妙的协同催化反应。
就像我们在画一幅画的时候，用了这个反应之后，画上的颜色可以变得更加独特，好像有了一种神秘的光泽，就像童话故事里那些被施了魔法的画一样。
植物学通报2003,20(4):469~475Chinese Bulletin o f Botany漆酶的性质、功能、催化机理和应用¹王国栋陈晓亚º(中国科学院上海生命科学研究院,植物生理生态研究所上海200032)摘要漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白,是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员。
本文叙述漆酶的分子结构、底物特异性及其物理化学特性,并讨论漆酶的酶促反应机理和生物学功能,包括植物漆酶参与细胞壁的形成以及漆酶与病原菌毒力的关系。
本文还着重介绍了漆酶在环境生物修复方面的应用。
关键词漆酶,病原菌毒力,生物修复,功能,催化机理The Properties,Functions,Catalytic Mechanism andApplicability of LaccaseW ANG G uo_Dong C HE N Xiao_Yaº(Ins titute o f Plant Physiology and Ecology,S hanghai Ins titutes for Li fe Sciences,C AS,Shanghai200032)Abstract Laccase belongs to the family of multicopper oxidases.In this review,the molecular structure,substrate specificity,catalytic mechanism and other physicochemical parameters of laccase are sum marized.The role of laccase in plant cell wall formation and pathogen virulence are dis2 cussed.For applications,we pay special attention to the potential of laccase in bioremediation. Key words Laccase,Pathogen virulence,Bioremediation,Function,Catalytic mechanism漆酶(EC1.10.3.2)由于首次从日本漆树(Rhus venic i f e ra)的汁液中分离而得名,漆酶属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员,该蛋白家族还包括人体血浆铜蓝蛋白(EC1.10.3.1)和植物抗坏血酸氧化酶(EC1.10.3.3),其中漆酶的结构最简单。
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漆酶羟基自由基漆酶是一种常见的化学物质，它是一种聚合物，可以用于制造各种涂料、油漆、胶水等。
而羟基自由基则是一种反应中的中间体，它在许多化学反应中都扮演着重要的角色。
本文将介绍漆酶和羟基自由基的相关知识。
漆酶的结构和性质漆酶是一种聚合物，它的分子结构中含有许多的羟基（-OH）和甲基（-CH3）基团。
漆酶的分子量很大，通常在几千到几十万之间。
漆酶的性质与其分子量有关，分子量越大，漆酶的粘度越高，固体含量也越高。
漆酶可以用于制造各种涂料、油漆、胶水等。
它的主要作用是增加涂料的粘度和附着力，使其更容易涂抹在物体表面上，并且能够形成坚固的涂层。
漆酶还可以用于制造各种塑料、橡胶等材料，以及医药、食品等领域。
羟基自由基的生成和反应羟基自由基是一种反应中的中间体，它在许多化学反应中都扮演着重要的角色。
羟基自由基的生成通常是通过光化学反应或热化学反应来实现的。
在光化学反应中，通常使用紫外线或可见光来激发分子中的电子，从而产生羟基自由基。
在热化学反应中，通常使用高温或高压来促进反应，从而产生羟基自由基。
羟基自由基在许多化学反应中都扮演着重要的角色。
例如，在氧化反应中，羟基自由基可以与氧气反应，形成羟基过氧化物自由基，从而促进反应的进行。
在还原反应中，羟基自由基可以与其他分子反应，从而将它们还原为更简单的物质。
在聚合反应中，羟基自由基可以与其他分子反应，从而形成更大的分子。
漆酶和羟基自由基的应用漆酶和羟基自由基在许多领域都有广泛的应用。
例如，在涂料和油漆中，漆酶可以增加涂料的粘度和附着力，从而使其更容易涂抹在物体表面上，并且能够形成坚固的涂层。
羟基自由基可以用于制造各种聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯等。
在医药领域，漆酶和羟基自由基可以用于制造各种药物，例如抗生素、抗癌药物等。
漆酶和羟基自由基是两种非常重要的化学物质，它们在许多领域都有广泛的应用。
通过深入了解它们的结构和性质，我们可以更好地利用它们的特性，从而推动各个领域的发展。
漆酶的应用技术. .第卷第期中国生漆年月. . / . . . . .漆酶的应用技术靳蓉,张飞龙西安生漆涂料研究所,陕西西安摘要:漆酶是一种广泛分布的多酚氧化酶,催化底物具有广谱性,被应用于造纸、环保、食品、医药、纺织等各个领域。
漆酶既能催化木质素聚合,又能促进木质素降解;既被用于生漆固化成膜,木质素聚合改性、提高纤维素间的自粘合性、纸张漂白、纺织废水处理和染料合成,又被用于果汁和酒类澄清,改善饮料的色泽和口感。
漆酶催化反应形成的自由基对癌细胞有杀伤作用,可制备抗癌药物。
在免疫检测中,利用漆酶催化的氧化反应特性能去除胆红素和抗坏血酸等干扰物质,还可替代过氧化物酶作为新的标记酶。
在生物修复中漆酶可有效降解酚类等污染物。
随着分子生物学进展,漆酶的新用途将会被不断挖掘,给人类带来福音。
关键词:漆酶;多酚氧化酶;应用 : ,, ,,, . ? , ? ;, , , , , ,, ., ,? . , , . .. , , .: ;;漆酶 , ,. . . ,即对一二酚: 随着分子生物学的发展,利用微生物作为载体,双氧氧化还原酶,是年本学者吉田构建漆酶的功能性表达系统,可使得漆酶的大规模从漆树的漆液中发现的一种含生产成为可能,有助于改善目前漆酶产量低、价格昂铜的糖蛋白氧化酶。
在过去的几十年,漆酶因其广贵、不能大范围产业化的现状。
另外极端环境微生泛而环保的应用价值,备受研究者和生产加工者的物研究的进展,有助于适应极端环境下应用的新型关注,其身影几乎出现在化学、生物学、环境科学和漆酶形成,将给一些特殊领域的工业化应用带来福医药等各个领域¨。
音。
收稿日期:一 ?作者简介:靳蓉,女,年毕业于北京协和医学院,获硕士学位,研究方向为漆树资源基金项目:国家“十二五”科技支撑计划项目,项目编号:年第期靳蓉等:漆酶的应用技术目前,已发现在有机溶剂存在的条件下,漆酶可材料科学以催化木质素与丙烯酰胺发生自由基接枝共聚,生Ⅳ成水溶性的木质素共聚产物。
laccase的分类
漆酶（Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌等生物体中。
根据来源和结构差异，漆酶可以分为以下几类：
1、真菌漆酶：真菌是漆酶的主要来源，其中担子菌门中的白腐菌是产生漆酶的最典型和最多样的菌种。
真菌漆酶根据其铜结合结构域的数目，可以分为单铜漆酶和多铜漆酶。
单铜漆酶只含有一个铜结合结构域，而多铜漆酶含有多个铜结合结构域。
2、细菌漆酶：与真菌漆酶相比，细菌漆酶的种类较少。
目前发现的细菌漆酶主要来源于革兰氏阴性菌，如假单胞菌属、芽孢杆菌属等。
与真菌漆酶相比，细菌漆酶的分子量较小，但它们在工业化应用方面具有潜力。
3、植物漆酶：植物中也存在漆酶，但与真菌和细菌漆酶相比，植物漆酶的种类和数量较少。
植物漆酶在植物体内的作用尚不完全清楚，但可能与植物的抗病性和木质素降解有关。
4、昆虫漆酶：昆虫中也存在漆酶，主要参与昆虫的变态过程和外骨骼的着色。
昆虫漆酶可以分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型漆酶参与昆虫的变态过程，而Ⅱ型漆酶与昆虫外骨骼的黑色素合成有关。
除了以上分类，漆酶还可以根据其底物特异性和反应条件等进行进一步的分类。
例如，一些漆酶可以作用于多种类型的底物，而另一些漆酶则具有较高的底物特异性。
此外，漆酶的反应条件也各不相同，一些漆酶在常温常压下即可发挥活性，而另一些漆酶则需要较高的温度或压力才能发挥最佳活性。
总的来说，漆酶是一个多样性的蛋白质家族，其结构和功能在不同的生物体和环境下都有所不同。
未来随着蛋白质工程和基因工程技术的发展，我们有望获得更多具有特定应用价值的重组漆酶，以满足环境保护、食品加工和生物医药等领域的需求。
树脂是工业中使用得比较广泛的材料，它价格低廉、机械强度好、物化性能稳定、容易再生，用作固定化酶的载体将会有很好的发展前景。
离子交换树脂是一类不溶也不熔且具有三维空间网状骨架结构亲水性的功能高分子。
连接在树脂骨架上的功能基，可通过吸附、共价键、离子键、配位键、交联、微胶囊等形式以及其他手段将酶固定在树脂上，构成固定化酶［65］。
树脂D380是一种浅黄色球形大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上带有伯胺基，属于反应性高分子材料。
该树脂表面的功能基团-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反应生成西弗(Schiff)碱，而戊二醛的另一个醛基可以连接酶蛋白中游离的 -NH2,因此达到固定化酶的目的。
2. 1实验部分2. 1. 1实验仪器和试剂2. 1. 1. 1.实验仪器试验中用到的主要实验仪器见表2. 1。
气浴恒温振荡器THZ-92B型数显恒温水浴锅HH-S型电子分析天平AB204-N型紫外一可见光分光光度计VIS-7220G循环水真空泵SHI-III型2. 1. 1. 2.实验试剂主要实验试剂见表2.2。
真菌漆酶>20u/mg树脂D380戊二醛分析纯邻联甲苯胺分析纯醋酸分析纯醋酸钠分析纯碳酸氢二钠分析纯碳酸二氢钠氢氧化钠盐酸 2. 1. 2实验方法2. 1. 2. 1树脂D380的预处理取一定量的树脂，去离子水浸泡24h,然后用5%HCL 浸泡12h,洗涤全中性 后再用2%的Na0H 浸泡1 2h,再次洗涤全中性，最后以去离子水浸泡备用。
2. 1. 2. 2漆酶的固定化首先，采用两种方法路线固定化漆酶：先用戊二醛交联载体后再吸附漆酶和 先用载体吸附漆酶后再用戊二醛交联，分别测定两种方法固定化漆酶的活力，流 程见图2. 1所示。
其中戊二醛浓度为2%(V:V)，加入量为20mL ，缓冲溶液为5 mLpH 为5. 5的醋酸缓冲溶液，酶液为10mL 浓度1 mg/mL 的稀释酶液。
实验结果表明前 者效果明显优于后者，因此后续实验均采用此法进行。
《环境生物技术》论文——漆酶对污染物降解的研究漆酶对环境污染物降解的研究摘要：漆酶是一种含铜多酚氧化酶，该酶是一种氨基酸残基在500个左右的单体酶，一般都为酸性蛋白，漆酶的应用集中在以下几方面：生物漂白，环境治理，漆酶降解有害物质，工业废水处理；其他方面的应用；等等。
本文进行了漆酶对废水降解的初步研究，并对染料废水的降解机理和部分影响因素进行了一定的分析探讨。
关键词：漆酶、应用、降解机理、影响因素。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶家族中的同一小族，在结构和功能上存在着许多相似之处。
它最早是从日本漆树的汁液中发现的，后来也发现其存在于多种植物、昆虫和高等真菌中【1】。
不同来源的漆酶具有不同的催化性质．即使是相同来源，比如同一白腐菌菌种，可分泌多种具有不同性质的漆酶组分，包括氧化能力，酶蛋白分子量，最适pH值、底物的专一性等等…，因此所起的作用是各不相同的。
在漆酶降解木素方面已进行了较多较深入的研究，漆酶除了能氧化木质素以外，还被证明能催化多种底物，如酚类化合物及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及甾体激素等【2】。
由于许多漆酶氧化的底物为环境污染物，因此利用白腐真菌产生的漆酶处理印染废水，降解染料化合物的研究在环境保护中具有十分重要的意义。
应用漆酶来实现纸浆的生物漂白正是研究的一个热点【3】；另外，漆酶还具有降解氯化有机物去除环境中有毒污染物毒性的作用，本文就漆酶的这一性质做一介绍。
1漆酶的催化机理一般认为生物法降解主要有两种机理在起作用：吸附和降解，以降解为主。
生物降解又分为两步：一是染料分子吸附到菌体上，部分透过细胞膜进入细胞体内；二是利用微生物产生的酶催化氧化还原染料分子，破坏不饱和共轭体系，达到去色的目的，中间产物进一步氧化还原分解并最终分解为C02和水或转化为所需的营养物质，组成新的原生质【4】。
根据对漆酶光谱学、动力学和晶体衍射的研究，漆酶催化底物的方式可能如下：底物结合于酶活性中心的I型铜原子位点，通过cys．His途径将其传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水。
漆酶性质及应用漆酶(1accase)是一种含铜的多酚氧化酶，通常由500个氨基酸单一多肽组成,其中含有19种氨基酸，漆酶有一定的含糖量[1]。
真菌漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu2+三个部分组成，分子量在60-390kDa之间[2]。
肽链一般由500-550个氨基酸组成[3]，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10%-80%。
糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因。
漆酶一般含有4个铜离子(P. radiate漆酶除外,仅含2个铜离子,无3号铜离子)。
根据其光谱特征,可划分为3种类型的铜: 1号铜(只有一个铜离子,顺磁性)具有典型的蓝铜谱带:紫外可见光谱上600nm [ε: 5000 (mol·L-1cm)-1]处出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有一个小的平行超精细耦合结构[A11:(4070) * 10-4cm-1],它参与分子内的电子传递,把电子从底物传递到其他铜原子上; 2号铜(只有一个铜离子,顺磁性)只具一般的EPR谱带(A11>140×10-4m-1); 3号铜由2个3号铜原子通过一个OH桥配位连接起来,组成双核铜区,具有抗磁性,因而在EPR上无谱带,紫外可见光谱上330nm处的肩峰是3号Cu2+的特征峰。
漆酶空间结构更详细的资料来自其晶体衍射的研究。
含四个铜原子的酶分子是常见的形式,而某些酶蛋白的辅基有例外的情况。
Karhunen E[4]等的研究指出,phlebia radiata产生的漆酶中只含有2个铜原子，另外还有一分子的有机小分子辅基吡咯喹琳醌(pyrroloquinolin-equi-none, PQQ),该辅基在分子中扮演类似Ⅲ型铜原子的功能。
漆酶能够催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水，属于铜蓝氧化酶(或称为铜蓝蛋白酶)中的一小族，广泛存在于真菌、植物和昆虫中，有报道细菌也能产生漆酶I21。
漆酶含有的铜离子，它们位于酶的活性位，在氧化反应中能够协同传递电子并将氧还原成水。
目前, 研究最多的产漆酶微生物大多是白腐真菌, 主要有黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇等。
1883年Yoshida[5]最先从漆树液中发现了漆酶131，后来被Bertranc命名。
我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等，他们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶酶活的测定方法。
随后，直到20世纪80年代末，国内对于漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表观特性的描述性研究上；与此同时，漆酶的分离纯化、动力学特性和固定化的研究也开始起步。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，漆酶的研究也取得了令人瞩目的成绩，学者们已经测定了漆酶的氨基酸序列，克隆了它的基因，并研究了漆酶的编码基因及其表达调控机制。
以上种种研究成果都推动了漆酶在食品、环保等工业方面的应用。
目前，在国内漆酶主要被应用在环保工业上，特别是在污水处理、纸浆的生物漂白及有毒化合物的生物降解等方面。
Ⅰ性质㈠真菌漆酶的理化性质[6]：①含糖量：近来有研究发现,含糖量高的漆酶既不能提高漆酶的热稳定性,也不能阻止由紫尿酸自由基引起的漆酶失活。
这一实例打破了原有认识:糖基化和漆酶的分泌、铜原子的保留以及热稳定性的提高有关。
②氧化还原电势：木材中最主要的木质素结构单元是非酚型单元,其氧化还原电势较高。
到目前为止,已发现漆酶的最高氧化还原电势不超过800mV,这对氧化非酚型单元是显然不够的。
近来发现,漆酶能氧化一些氧化还原电势高于漆酶的介体。
后来,有人研究发现漆酶的氧化还原电势与其对介体的氧化并没有直接的联系,但对一个有效的漆酶-介体体系来说,漆酶必须有一个足够高的氧化还原电势使漆酶对介体的氧化在动力学上成为可能。
③等电点(PI):大多数漆酶的PI值在3-5的范围内。
④分子质量：不同的漆酶,氧化能力不一样,其分子质量也相差很大。
⑤N端氨基酸序列：同源性担子菌漆酶的N端氨基酸序列具有很大的相似性,而已知的子囊菌N端氨基酸序列都不具有相似性,与担子菌漆酶的序列也相差很大。
对于同一种漆酶的同工酶来说,它们的N端氨基酸序列非常相似,甚至完全相同。
⑥漆酶的氧化特性：漆酶是单电子氧化还原酶，可以催化6类底物：酚及其衍生物；芳胺及其衍生物；羧酸及其衍生物；甾体激素和生物色素；金属有机化合物；其它非酚底物。
漆酶氧化速率的大小不仅与漆酶本身的稳定性有关，而且也与漆酶与底物作用的一些动力学参数如K(表观速率常数)有关。
⑦对抑制剂的敏感性：一般来说,铜螯合剂对漆酶的活性都有抑制作用不同的抑制剂对漆酶活性的抑制作用不一样。
同一种抑制剂对不同的菌种其抑制作用也不一样。
⑧反应动力学：在一定的温度范围内，随着反应温度的升高，漆酶的酶活力增加。
但温度越高，漆酶越不稳定，越易失活。
酶活性随温度的升高先升高后降低。
pH值对漆酶酶活性亦有类似影响。
一般来说，大多数漆酶在碱性环境中不稳定、易失活。
因此，把漆酶用于纸浆漂白时应同时考虑漆酶的稳定性和反应的最适温度及pH值，以达到最佳的漂白效果。
如何提高漆酶的稳定性已成为许多研究者研究高效漆酶的一个重要内容。
近来有报道，C. thermophilium漆酶比一般的真菌漆酶具有更高的热稳定性并在pH 值为6.8时反应较适宜。
漆酶反应的最适pH值随反应底物的不同而不同, Km值也不同。
Km值的大小可以反映出漆酶对底物亲和力的大小，而漆酶对底物的亲和力又是影响漆酶氧化底物速率的一个重要因素。
Km值越小，亲和力越大，漆酶对底物的氧化率也就越高。
测定漆酶活性的方法有HPLC法、测压法、分光光度法、级谱法等。
目前常以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)为底物,测定酶对其的氧化速度。
以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。
文献报道，以ABTS 为底物测定漆酶酶活力，漆酶的最适温度大约在30-60℃。
且稳定性较好。
在pH=3 时酶活最高，在pH=5-7之间稳定性较好。
[7]㈡真菌的分子生物学及其生物学功能⒈漆酶的分子生物学研究[4]当前,漆酶的分子生物学研究主要体现在三方面:漆酶基因的克隆、漆酶基因结构和组织分析、漆酶基因的异源表达。
已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。
一些特殊序列的存在与否决定了该酶的表达形式-诱导型或组成型,诱导型菌株的调控序列中含有一段受酚类化合物作用的序列,而不含有该序列的酶基因则都是组成型表达的。
漆酶的异源表达和表达调控则还有很多工作要做,这些工作的突破将使漆酶的应用和它在个体发育中的功能得到分子水平上的解释。
⒉漆酶的分子生物学功能漆酶的分子生物学功能体现在四方面:对植物的保护作用,如Botrytis Cinerea 菌产生的胞外漆酶可保护植物免受感染和腐烂;对植物形态产生的作用,如根状体菌丝体束的形成,就是因为漆酶能在细胞间催化酚类化合物的聚合黏连来固定菌丝;参与木质素的生物合成、降解和土壤腐殖质的形成;漆酶参与连续反应链中起传递电子和催化氧化作用。
Ⅱ应用㈠在食品加工中的应用漆酶在食品工业上的应用是近20年发展起来的，主要在饮料加工、食品成分测定以及食品组分功能改进等方面。
⒈饮料加工饮料中的酚类化合物极易发生氧化反应，从而引起饮料的后混浊、色泽加深及香味与口感下降等问题，最终导致饮料变质。
而漆酶能够氧化多酚类物质生成多酚氧化物，多酚氧化物自身能够发生再聚合，形成可以被滤膜截留的大颗粒，最终达到净化饮料的目的。
由于这一催化反应专一性强，污染问题少，澄清的果汁色浅且稳定，因此漆酶的应用成为饮料加工中的热点。
研究表明，漆酶的作用效果不仅优于物理、化学方法，也优于其它酶(如单宁酸酶、酚酶和花色素酶等)的作用效果[8]。
20世纪90年代初还出现了利用固定化漆酶去除多酚物质的技术，即通过物理或化学的方法将漆酶以共价结合的方式固定于有机物或无机物的支持介质上，然后用于除去多酚；使用的介质包括分子筛、硅胶、琼脂糖、戊二醛等。
由于固定化漆酶储存在适当的条件下，活性损失很小，并可重复使用，使其在食品加工中有着广泛的应用前景。
⒉食品成分测定以Meneguzzo 为代表的部分学者认为漆酶酶活的变化与葡萄饮料变质程度成正相关；而以Perino为代表的另一部分学者则认为二者间并不存在正比关系，酶活的变化是由灰霉菌引起的。
虽然对此争论还未达成共识，但如果漆酶果真能够作为葡萄饮料的变质指示剂，那么将出现一种快速简便的葡萄饮料变质检测方法。
⒊食品成分的功能性改进Pertersen利用漆酶中铜离子的催化特性，除去沙拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧，消除了食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分，达到了改良食品感官参数的目的。
在烘烤工业中，漆酶通过氧化芳香族氨基酸，使得烘焙制品口感酥软、风味好、体积大、硬度低、稳定性好。
⒋生产食用菌木耳、香菇、猴头、多脂鳞伞、亚侧耳、草菇等食用菌中都含有漆酶，由于漆酶所具有的催化活性，使其在食用菌的生产中起着至关重要的作用。
其主要作用有：参与木质素的降解，为菌体的生长发育提供营养；参与菌体的呼吸作用，促使菌体生长发育；利用其对木质素的特殊降解作用，使液体培养菇类成为可能；在菇类的袋料栽培过程中，参与菌简转色而改善产品质量；能有效抑制杂菌的污染。
㈡在环保工业中的应用利用酶制剂进行污染物处理和环境监测具有效率高、速度快、可靠性强等优点，因此酶和酶技术在环境治理方面具有较高的应用价值。
现代环保技术应用漆酶进行生物整治和生物漂白，给环境保护带来了光明的前景。
⒈生物整治生物整治主要包括工业废水处理、有毒农药的分解等，其目的有二，一是从排除物中除去有害物质并降低其毒性，二是将有害物质转变为有经济价值的产物。
漆酶能够降解广泛应用于染料、颜料、防腐剂、除草剂、杀虫剂和杀菌剂等化学制剂中的氯酚类化合物和苯胺取代物[9]，而在生物整治中被广泛应用。
近年来,随着人们环保意识的增强,漆酶在污水治理方面的作用显得越来越重要,成为酶工程与环境保护交叉领域研究的热点。
⒉生物漂白和脱色生物漂白，就是利用微生物或其分泌的酶处理纸浆，达到脱除木素、改善纸浆的可漂性并提高纸浆白度的一种方法。
真菌漆酶具有单电子氧化还原电位高、催化活性强等特点,可以氧化芳香环化合物,对纺织染料的脱色及降解效果明显。
目前许多工厂排放的有毒废水对环境造成了严重污染，大量化学品的使用使这种情况更加严重。
用生物学方法进行废水处理，不仅能减轻环境的压力，而且能提高产品的品质。
因此，利用漆酶进行生物漂白和脱色将更加现实和可行。
㈢其他应用漆酶可催化木质素降解，在纸浆生产过程中添加一定量的漆酶可以增加纸浆的得率，提高经济效益，因而可将其应用于造纸工业。
