原核表达

将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1 mg / mL DNase I。

2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。

原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。

本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。

1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。

表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。

（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。

（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。

常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。

（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。

宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。

2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。

（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。

转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。

（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。

转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。

（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。

通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。

3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。

（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。

②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。

原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。

37℃，过夜摇菌。

2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。

（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。

大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。

二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。

根据这个结果选择纯化方法。

（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。

（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。

三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。

4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。

（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。

原核表达密码子偏好概述及解释说明1. 引言1.1 概述原核表达密码子偏好是指原核生物在蛋白质合成过程中对编码氨基酸的密码子选择存在一定规律性。

密码子是由三个核苷酸组成的序列，用于编码不同的氨基酸。

在原核生物中，有些密码子被广泛使用，而其他密码子则较少使用。

这种密码子偏好现象引发了科学家们的兴趣，并且对研究人员揭示了一些有关遗传信息传递机制和生物进化的重要见解。

1.2 文章结构本文将以以下几个部分来描述原核表达密码子偏好。

首先，在第2部分中，我们将概述原核表达密码子偏好的基本概念和背景知识。

然后，在第3部分中，我们将解释说明影响原核表达密码子偏好的主要原因和机制。

接下来，在第4部分中，我们将通过实例分析具体介绍常见原核生物中的密码子偏好现象及其解释。

最后，在第5部分中，我们将总结原核表达密码子偏好的特点并展望该领域未来的研究方向。

1.3 目的本文旨在深入探讨原核表达密码子偏好的现象和机制，并通过实例分析加深对该领域的理解。

了解原核表达密码子偏好对我们揭示细胞功能和进化过程具有重要意义。

同时，本文也希望能够促进对密码子偏好研究领域的发展，为未来的研究提供新的思路和方向。

2. 原核表达密码子偏好概述：2.1 什么是原核表达密码子偏好原核生物中的基因编码信息通过密码子来进行转录和翻译，密码子是由三个核苷酸组成的序列，每个密码子对应着一个氨基酸。

然而，在同一种原核生物的基因组中，对于某些氨基酸来说，并非所有可能的密码子都被等概率地使用。

相反，原核生物存在一种选择性地使用某些密码子来编码特定氨基酸的现象，这就是原核表达密码子偏好。

2.2 密码子的定义和功能在DNA或RNA序列中，每三个连续的核苷酸被称为一个密码子。

根据遗传密码表，不同的密码子对应着不同的氨基酸，起到了翻译基因信息为蛋白质序列的作用。

2.3 原核生物中密码子使用的规律性原核生物在使用密码子时并非随机选择，而是存在一定程度上的规律性。

具体而言，原核生物中较为常见或者富集的密碼雙取决于其所编码氨基酸出现频率及其它影响因素。

原核表达步骤总结原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。

本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达制样 (一)1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Ampo(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。

(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。

7ml菌液加入7o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。

5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，2倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离心管中的水倒干净。

(二)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。

用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。

做原核表达的几点教训和体会最近在做原核表达，包涵体。

以前也做过，但经验不多。

一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。

载体是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。

菌株是该公司的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。

2. 第一次失败。

第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。

PCR，酶切都正确。

但没等测序结果出来就开始做了。

失败了。

曾在园子求助。

后来证明是引物错误。

我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。

这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。

教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。

引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。

3. 第二次失败。

后来重新构建，转化，诱导。

第一次诱导时根本就没带。

见附图（图片质量太差了，sorr y，下面几个帖会逐渐好转。

我们都在失败中提高，进步，不是吗）然后开始找闷头原因。

周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。

这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的A mp。

对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。

到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。

一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。

当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。

所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。

转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。

原核表达--表达前的分析比什么都重要表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。

表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。

原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。

当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。

原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。

做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。

首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。

前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。

同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。

当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。

如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。

比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。

根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。

在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子GC含量表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

GC含量可以利用DNA STAR、V ector NTI Suite等软件进行预测。

二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。

最近在做原核表达，包涵体。

以前也做过，但经验不多。

从园子里也学到不少。

一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。

载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。

菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。

2. 第一次失败。

第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。

PCR，酶切都正确。

但没等测序结果出来就开始做了。

失败了。

曾在园子求助。

后来证明是引物错误。

我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。

这个office 的老太太把引物弄掉了一个碱基。

教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。

引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。

3. 第二次失败。

后来重新构建，转化，诱导。

第一次诱导时根本就没带。

见附图（图片质量太差了，sorry，下面几个帖会逐渐好转。

我们都在失败中提高，进步，不是吗）然后开始找闷头原因。

周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。

这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。

对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。

到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。

一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。

当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。

所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。

转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。

大肠原核表达【实用版】目录1.大肠杆菌原核表达系统简介2.大肠杆菌原核表达的优势3.大肠杆菌原核表达的过程4.大肠杆菌原核表达的应用领域5.大肠杆菌原核表达的展望正文一、大肠杆菌原核表达系统简介大肠杆菌原核表达系统是一种利用大肠杆菌进行蛋白质表达的技术手段。

在这个系统中，外源基因被插入到大肠杆菌的表达载体中，通过诱导剂的作用，使大肠杆菌表达出目标蛋白质。

这种表达方式具有高效、快速、简单等优点，因此在生物技术领域得到了广泛的应用。

二、大肠杆菌原核表达的优势1.高表达水平：大肠杆菌具有较高的表达水平，能够快速产生大量目标蛋白质。

2.表达速度快：大肠杆菌原核表达系统具有较快的表达速度，通常在几小时内即可完成表达。

3.简单易操作：大肠杆菌原核表达系统操作简单，不需要复杂的实验设备和技术，适合实验室和工业生产。

4.低成本：大肠杆菌原核表达系统成本较低，有利于降低生产成本和研究投入。

三、大肠杆菌原核表达的过程大肠杆菌原核表达的过程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：将目标基因插入表达载体中，形成重组表达载体。

2.转化大肠杆菌：将重组表达载体转化到大肠杆菌中，使大肠杆菌具有表达目标蛋白质的能力。

3.诱导表达：通过添加诱导剂，诱导大肠杆菌表达目标蛋白质。

4.收集和纯化蛋白质：从大肠杆菌中收集和纯化表达的蛋白质。

四、大肠杆菌原核表达的应用领域大肠杆菌原核表达系统在多个领域都有广泛应用，包括生物制药、生物材料、生物能源等。

例如，利用大肠杆菌原核表达系统生产重组蛋白、酶、抗体等生物制品，以及生产生物降解材料、生物燃料等。

五、大肠杆菌原核表达的展望随着科学技术的发展，大肠杆菌原核表达系统在生物技术领域将发挥更大的作用。

未来，该技术将在提高表达水平、缩短表达时间、降低生产成本等方面取得更多突破，以满足不断增长的生物产业需求。

大肠原核表达大肠原核表达是一种常用的蛋白质表达系统，广泛应用于生物医学研究和生物工程领域。

大肠杆菌是最常用的宿主细胞，其原核表达系统具有高效、简便、经济的特点，因此被广泛应用于蛋白质的大规模表达和纯化。

大肠原核表达系统的基本原理是将目标基因插入到原核表达载体中，并将该载体转化到宿主细胞中。

在宿主细胞内，目标基因会受到宿主细胞的转录和翻译机制的调控，从而实现目标蛋白质的表达。

大肠原核表达系统的优势之一是宿主细胞的生长速度快，表达量高，适合大规模表达目标蛋白质。

此外，大肠原核表达系统还可以通过调节宿主细胞的生长条件和表达条件来实现蛋白质的高效表达。

大肠原核表达系统的关键步骤包括：选择合适的表达载体、构建重组载体、转化宿主细胞、筛选阳性克隆、培养大肠杆菌、诱导蛋白质表达、纯化目标蛋白质等。

其中，选择合适的表达载体是非常重要的一步。

常用的表达载体包括质粒和噬菌体。

质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达目标基因。

噬菌体则是一种寄生菌体，可以在宿主细胞内复制和表达目标基因。

根据需要选择合适的表达载体，可以实现不同类型蛋白质的高效表达。

另外，构建重组载体也是大肠原核表达系统中的重要步骤。

在构建重组载体时，需要将目标基因插入到载体的适当位置，并确保其与载体的连接正确。

常用的方法包括限制性内切酶切割、连接酶法和PCR扩增法等。

通过这些方法，可以将目标基因插入到载体中，并确保其正确复制和表达。

转化宿主细胞是大肠原核表达系统中的关键步骤之一。

转化是指将重组载体转入到宿主细胞中，并使其在细胞内复制和表达。

常用的转化方法包括热激转化法、电穿孔法和化学转化法等。

通过这些方法，可以将重组载体转入到大肠杆菌中，并使其在细胞内复制和表达。

筛选阳性克隆是大肠原核表达系统中的另一个重要步骤。

由于转化后的宿主细胞中可能存在非重组或空载体，因此需要进行筛选来寻找阳性克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选法、荧光筛选法和酶活性筛选法等。