植物基因分离的图位克隆技术
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分子植物育种， ２００５ 年， 第 ３ 卷， 第 ４ 期， 第 ５８５－５９０ 页 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２００５， Ｖｏｌ．３， Ｎｏ．４， ５８５－５９０
实验方法 ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ
植物基因分离的图位克隆技术
闫其涛 逯慧 毛万霞 李建粤 ＊
上海师范大学生命与环境科学学院， 上海， ２００２３４ ＊ 通讯作者， ｌｉｊｉａｎｙｕｅ０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
传统的基因功能克隆、 表型克隆方法具有基因表达产物不清楚， 难以进行相关基因分离等缺点。 目前， 图位克隆技术日渐成熟， 已成为分离基因的有效方法， 并在分离不同的植物基因中得到了广泛的应 用。本文简要介绍图位克隆技术原理， 并详细阐述图位克隆操作的 ４ 个重要技术环节： 筛选与目的基因紧 密连锁的分子标记、目的基因近年来利用图位克隆技术分离植物基因的研究成果以及最新研究进展， 并对图位技术的 应用前景作出展望： 在不久的将来， 在比较基因组学中统一遗传系统理论的指导下， 在具有高多态性水平 的以 ＰＣＲ 为基础的分子标记日趋饱和的背景下， 应用图位克隆技术在植物基因克隆研究中必将取得更加 辉煌的成果。 图位克隆， 分子标记， 定位， 染色体步移
图 １ 图位克隆法示意图 注： Ｍ１、 Ｍ２ 为不同的分子标记 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｎｏｔｅ： Ｍ１ ａｎｄ Ｍ２ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｂｅｌｓ
植物基因分离的图位克隆技术 Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔｓ Ｇｅｎｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
５８７
ＳＳＬＰ 是基于 ＰＣＲ 的分子标记， 检测比较直接， 只需 要通过设计引物便可检测假定的 ＳＳＬＰ 标 记 ； 对 ＳＮＰｓ 标记的检测也比较直接， 它是不同生态型之间 基因组中的单个核苷酸的差别， 这些差别的核苷酸 通常位于不编码区域（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。最常见的 用于检测 ＳＮＰｓ 标记的方法主要是剪切扩增多态性 序列（ＣＡＰＳ）， 它也是基于 ＰＣＲ 的。另外， 一种更为 有效的方法衍生的 ＣＡＰＳ （ｄＣＡＰＳ） （Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａ－ ｍａｓｉｎｏ， １９９８； Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８９）可把任何已知的点突 变作为分子标记，只要在 ＰＣＲ 时引入不配对的引 物， 使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切 位点， 而在另一生态型中没有， 以形成多态性。随着 分子标记技术的发展， 一些植物的遗传图谱构建和 比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有 益的借鉴。
Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔｓ Ｇｅｎｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｙａｎ Ｑｉｔａｏ Ｌｕ Ｈｕｉ Ｍａｏ Ｗａｎｘｉａ Ｌｉ Ｊｉａｎｙｕｅ＊
Ｃｏｌ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２００２３４ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｌｉｊｉａｎｙｕｅ０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｔｈｅ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗａｙｓ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｈｏｎｅｔｙｐｉｃａｌ ａｎａｌ－ ｙｓｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｕｎｅａｓｙ－ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｈａｓ ｂｅｉｎｇ ｐｅｒｆｅｃｔｅｄ ｎｏｗ， ａｎｄ ａｌｒｅａｄｙ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｖａｌｕａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ａ ｌｏｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｒｉｅｆｌｙ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｎｄ ｇｉｖｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐｓ ｂｙ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｉｎｇ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ，ｏｒｉｅｎｔａｔｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｂｉｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ． Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｌｓｏ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｅｔ ｆｏｒｗａｒｄ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｉｎｇ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｕｉｄ－ ａｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ ｍａｒｋｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＣＲ ｉｎ ｈｉｇｈ ｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｉｓｍ， ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｉｇｈｔ ａｃｈｉｅｖｅ ｍｏｒｅ ｓｈｉｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ， Ｍａｐｐｉｎｇ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ 目前， 克隆基因的途径有 ２ 种： 正向遗传学（ｆｏｒ－ ｗａｒｄ ｇｅｎｃｔｉｃｓ） 和反向遗传学 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｃｔｉｃｓ） 途径。 前者是依据目的基因所表现的功能为基础， 通过鉴 定其产物或某种表型突变而进行的； 后者则着眼于 基因本身， 通过特定的序列或在基因组中的位置进 行。传统的功能克隆（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）属于前者范 畴，它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列，乙酰酶 ＨＤ２ 基 因的分离 ） （Ｌｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）， 也可以制备外， 还有近年来发展十分 迅速的表型克隆 （ｐｈｏｎｅｔｙｐｉｃａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ） （Ｊｏｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ， １９９５）， 例如差别筛选法、 扣除杂交技术、
是指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记， 鉴 定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的 Ｄｉｘｏｎ 等（１９９５）利用该方法已成功的将番 分子标记， 茄的叶霉病基因 !"# 精细定位到 ４０Ｋｂ 的区间。由 于侧翼分子标记需要对单个植株进行分析， 工作效 率比较低， 因此 Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ 等（１９９３） 提出混合样品作 图的方法进行目的基因的精细定位。混合样品作图 是指在准确鉴定目的基因表型 （单基因控制的隐性 突变） 的基础上， 把大群体中单株突变体分成若干 组 （通常 ５ 个单株一组） ， 以组为单位提取 ＤＮＡ， 形 成一个混合的 ＤＮＡ 池，用目的基因附近所有的分 子标记对混合的 ＤＮＡ 池进行分析，根据所有池中 的分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目 的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所 有分子标记的顺序。混合样品作图可以很大程度地 提高分子标记分析效率， 减小 ＤＮＡ 提取的工作量， 有利于扩大群体。 一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域 后， 接下来就要对其进行精细的作图。目前， 作图的 类型可分为 ２ 类， 分别是遗传图谱和物理图谱。遗 传图谱对图位克隆非常重要， 尤其是精细的遗传图 谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的 基础， 可以通过整合已有的遗传图谱， 或者是寻找 新的分子标记来实现。现在， 业已建图的植物已多 达几十种，其中几乎包括了所有重要的农作物， 如 玉米、 番茄、 水稻、 小麦、 大麦、 燕麦、 大豆、 高粱、 油 菜、 马铃薯等。由于许多科学家的共同努力和连年 的工作积累， 已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱 和， 如水稻已有 ２ ２７５ 个分子标记的图谱， 覆盖基因 组的 １ ５１２．６ｃＭ，这就为其物理图谱的构建奠定了 基础。物理图谱是真正意义上的基因图谱， 因为分 子标记与目的基因之间的实际距离是按碱基数（ｂｐ） 来计算的， 它会因不同染色体区域基因重组值的不 同而造成与遗传距离的差别。因此， 物理图谱的构 建也是图位克隆技术一个至关重要的环节。物理图 谱的种类很多， 从简单的染色体分带图到精细的碱 基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限 制酶切图谱、 跨叠克隆群和 ＤＮＡ 序列图谱等。目前 利用稀有切点内切酶结合 ＰＥＧＥ 技术已成功用于 植物基因组的大规模物理作图， 从而可以确定连锁 标记与目的基因间的实际物理距离的大小， 为基因 的克隆奠定了基础。
１ 图位克隆技术的原理
图位克隆 （ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ） 又称为定位克隆 （ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）， 最 先 由 １９８６ 年 剑 桥 大 学 的 Ａｌａｎ Ｃｏｕｓｌｏｎ 提出，是近几年来随着各种植物的分 子标记图谱相继建立而发展起来的一种新的基因 克隆技术。它是根据目的基因在染色体上的位置进 行基因克隆的一种方法， 其基本的原理是： 功能基 因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分 子标记技术对目的基因精细定位的基础上， 用与目 Ｃｏｓｍｉｄ 等）， 从而构建基因区域 的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移 （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ） 逼近目的基因或通过染色体 登陆 （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｌａｎｄｉｎｇ） （Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５） 方 法最后找到包含有该目的基因的克隆， 最后经遗传 转化试验证实目的基因功能。 该方法的步骤见图 １。
２ 图位克隆的技术环节
２．１ 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记
筛 选 与 目 标 基 因 连 锁 的 分 子 标 记 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ）是实现基因图位克隆的关键。实质上， 分子 标记是一个特异的 ＤＮＡ 片段或能够检出的等位基 因， 精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效 率。迄今为止， 已有几十种技术可用于分子标记的 ＲＦＬＰ 标记、 ＲＡＰＤ 标记、 ＡＦＬＰ 标记、 筛选， 包括有： ＳＳＬＰ 标记、 ＳＳＲ 标记、 ＳＮＰ 标记等。其中最为常用 的是简单序列长度多态性 （ＳＳＬＰｓ） （Ｌｕｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｃｈｏｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２） 和单核苷酸多态性 （ＳＮＰｓ） （Ｒａｆａｌｓｋｉ， ２００２）。
实验方法 ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ
植物基因分离的图位克隆技术
闫其涛 逯慧 毛万霞 李建粤 ＊
上海师范大学生命与环境科学学院， 上海， ２００２３４ ＊ 通讯作者， ｌｉｊｉａｎｙｕｅ０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
传统的基因功能克隆、 表型克隆方法具有基因表达产物不清楚， 难以进行相关基因分离等缺点。 目前， 图位克隆技术日渐成熟， 已成为分离基因的有效方法， 并在分离不同的植物基因中得到了广泛的应 用。本文简要介绍图位克隆技术原理， 并详细阐述图位克隆操作的 ４ 个重要技术环节： 筛选与目的基因紧 密连锁的分子标记、目的基因近年来利用图位克隆技术分离植物基因的研究成果以及最新研究进展， 并对图位技术的 应用前景作出展望： 在不久的将来， 在比较基因组学中统一遗传系统理论的指导下， 在具有高多态性水平 的以 ＰＣＲ 为基础的分子标记日趋饱和的背景下， 应用图位克隆技术在植物基因克隆研究中必将取得更加 辉煌的成果。 图位克隆， 分子标记， 定位， 染色体步移
图 １ 图位克隆法示意图 注： Ｍ１、 Ｍ２ 为不同的分子标记 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｎｏｔｅ： Ｍ１ ａｎｄ Ｍ２ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｂｅｌｓ
植物基因分离的图位克隆技术 Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔｓ Ｇｅｎｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
５８７
ＳＳＬＰ 是基于 ＰＣＲ 的分子标记， 检测比较直接， 只需 要通过设计引物便可检测假定的 ＳＳＬＰ 标 记 ； 对 ＳＮＰｓ 标记的检测也比较直接， 它是不同生态型之间 基因组中的单个核苷酸的差别， 这些差别的核苷酸 通常位于不编码区域（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。最常见的 用于检测 ＳＮＰｓ 标记的方法主要是剪切扩增多态性 序列（ＣＡＰＳ）， 它也是基于 ＰＣＲ 的。另外， 一种更为 有效的方法衍生的 ＣＡＰＳ （ｄＣＡＰＳ） （Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａ－ ｍａｓｉｎｏ， １９９８； Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８９）可把任何已知的点突 变作为分子标记，只要在 ＰＣＲ 时引入不配对的引 物， 使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切 位点， 而在另一生态型中没有， 以形成多态性。随着 分子标记技术的发展， 一些植物的遗传图谱构建和 比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有 益的借鉴。
Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔｓ Ｇｅｎｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｙａｎ Ｑｉｔａｏ Ｌｕ Ｈｕｉ Ｍａｏ Ｗａｎｘｉａ Ｌｉ Ｊｉａｎｙｕｅ＊
Ｃｏｌ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２００２３４ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｌｉｊｉａｎｙｕｅ０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｔｈｅ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗａｙｓ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｈｏｎｅｔｙｐｉｃａｌ ａｎａｌ－ ｙｓｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｕｎｅａｓｙ－ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｈａｓ ｂｅｉｎｇ ｐｅｒｆｅｃｔｅｄ ｎｏｗ， ａｎｄ ａｌｒｅａｄｙ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｖａｌｕａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ａ ｌｏｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｒｉｅｆｌｙ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｎｄ ｇｉｖｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐｓ ｂｙ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｉｎｇ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ，ｏｒｉｅｎｔａｔｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｂｉｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ． Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｌｓｏ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｅｔ ｆｏｒｗａｒｄ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｉｎｇ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｕｉｄ－ ａｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ ｍａｒｋｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＣＲ ｉｎ ｈｉｇｈ ｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｉｓｍ， ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｉｇｈｔ ａｃｈｉｅｖｅ ｍｏｒｅ ｓｈｉｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ， Ｍａｐｐｉｎｇ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ 目前， 克隆基因的途径有 ２ 种： 正向遗传学（ｆｏｒ－ ｗａｒｄ ｇｅｎｃｔｉｃｓ） 和反向遗传学 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｃｔｉｃｓ） 途径。 前者是依据目的基因所表现的功能为基础， 通过鉴 定其产物或某种表型突变而进行的； 后者则着眼于 基因本身， 通过特定的序列或在基因组中的位置进 行。传统的功能克隆（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）属于前者范 畴，它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列，乙酰酶 ＨＤ２ 基 因的分离 ） （Ｌｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）， 也可以制备外， 还有近年来发展十分 迅速的表型克隆 （ｐｈｏｎｅｔｙｐｉｃａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ） （Ｊｏｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ， １９９５）， 例如差别筛选法、 扣除杂交技术、
是指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记， 鉴 定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的 Ｄｉｘｏｎ 等（１９９５）利用该方法已成功的将番 分子标记， 茄的叶霉病基因 !"# 精细定位到 ４０Ｋｂ 的区间。由 于侧翼分子标记需要对单个植株进行分析， 工作效 率比较低， 因此 Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ 等（１９９３） 提出混合样品作 图的方法进行目的基因的精细定位。混合样品作图 是指在准确鉴定目的基因表型 （单基因控制的隐性 突变） 的基础上， 把大群体中单株突变体分成若干 组 （通常 ５ 个单株一组） ， 以组为单位提取 ＤＮＡ， 形 成一个混合的 ＤＮＡ 池，用目的基因附近所有的分 子标记对混合的 ＤＮＡ 池进行分析，根据所有池中 的分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目 的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所 有分子标记的顺序。混合样品作图可以很大程度地 提高分子标记分析效率， 减小 ＤＮＡ 提取的工作量， 有利于扩大群体。 一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域 后， 接下来就要对其进行精细的作图。目前， 作图的 类型可分为 ２ 类， 分别是遗传图谱和物理图谱。遗 传图谱对图位克隆非常重要， 尤其是精细的遗传图 谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的 基础， 可以通过整合已有的遗传图谱， 或者是寻找 新的分子标记来实现。现在， 业已建图的植物已多 达几十种，其中几乎包括了所有重要的农作物， 如 玉米、 番茄、 水稻、 小麦、 大麦、 燕麦、 大豆、 高粱、 油 菜、 马铃薯等。由于许多科学家的共同努力和连年 的工作积累， 已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱 和， 如水稻已有 ２ ２７５ 个分子标记的图谱， 覆盖基因 组的 １ ５１２．６ｃＭ，这就为其物理图谱的构建奠定了 基础。物理图谱是真正意义上的基因图谱， 因为分 子标记与目的基因之间的实际距离是按碱基数（ｂｐ） 来计算的， 它会因不同染色体区域基因重组值的不 同而造成与遗传距离的差别。因此， 物理图谱的构 建也是图位克隆技术一个至关重要的环节。物理图 谱的种类很多， 从简单的染色体分带图到精细的碱 基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限 制酶切图谱、 跨叠克隆群和 ＤＮＡ 序列图谱等。目前 利用稀有切点内切酶结合 ＰＥＧＥ 技术已成功用于 植物基因组的大规模物理作图， 从而可以确定连锁 标记与目的基因间的实际物理距离的大小， 为基因 的克隆奠定了基础。
１ 图位克隆技术的原理
图位克隆 （ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ） 又称为定位克隆 （ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）， 最 先 由 １９８６ 年 剑 桥 大 学 的 Ａｌａｎ Ｃｏｕｓｌｏｎ 提出，是近几年来随着各种植物的分 子标记图谱相继建立而发展起来的一种新的基因 克隆技术。它是根据目的基因在染色体上的位置进 行基因克隆的一种方法， 其基本的原理是： 功能基 因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分 子标记技术对目的基因精细定位的基础上， 用与目 Ｃｏｓｍｉｄ 等）， 从而构建基因区域 的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移 （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ） 逼近目的基因或通过染色体 登陆 （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｌａｎｄｉｎｇ） （Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５） 方 法最后找到包含有该目的基因的克隆， 最后经遗传 转化试验证实目的基因功能。 该方法的步骤见图 １。
２ 图位克隆的技术环节
２．１ 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记
筛 选 与 目 标 基 因 连 锁 的 分 子 标 记 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ）是实现基因图位克隆的关键。实质上， 分子 标记是一个特异的 ＤＮＡ 片段或能够检出的等位基 因， 精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效 率。迄今为止， 已有几十种技术可用于分子标记的 ＲＦＬＰ 标记、 ＲＡＰＤ 标记、 ＡＦＬＰ 标记、 筛选， 包括有： ＳＳＬＰ 标记、 ＳＳＲ 标记、 ＳＮＰ 标记等。其中最为常用 的是简单序列长度多态性 （ＳＳＬＰｓ） （Ｌｕｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｃｈｏｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２） 和单核苷酸多态性 （ＳＮＰｓ） （Ｒａｆａｌｓｋｉ， ２００２）。
