荧光siRNA产品使用说明

Nikon 80i荧光显微镜使用说明

△ 荧光显微镜属贵重仪器，未经保管人员同意请勿擅自使用。

△ 严格按照操作步骤进行，在使用过程中如发现问题应及时向保管人员反映。

△ 因违反操作规程，而导致仪器损坏，根据本中心《损坏仪器赔偿制度》进行赔偿。

△ 使用者在使用完毕后应进行登记.

维护和保养

本仪器应定期进行维护和保养。

 防止镜头霉变，定期除湿。

 为防止损坏荧光灯泡，荧光光源关闭后，15分钟内不得再重新开启。

 荧光灯泡的最佳使用期限是200小时，如发现荧光强度明显降低应更换荧光灯泡。

荧光显微镜操作步骤

△显微镜系精密仪器，务请不要碰击，要仔细耐心使用。

△荧光光源关闭后，15分钟内不得再开启。

△ 荧光灯泡的最佳使用期限是200小时，因此每次使用时请尽量缩短时间。

1.插上电源插座，打开主机电源开关。

2. 将待检标本置于载物台上。

3. 用10×物镜对焦点，根据使用者的眼间距调节双目镜筒的间距。

4. 调节光圈及灯光强度至合适位置。

5. 调节粗调和微调使标本至最清晰。

6. 拔出活动杆，使光路通过CCD至显示器。

7.保存图象至电脑中。

8. 使用完毕后关掉电源，如镜头上有指纹或污迹用擦镜纸将其擦除。

 荧光光源操作

1. 插上荧光光源电源插座，打开荧光光源电源开关。

2. 打开光栅。

3. 根据使用荧光素的不同选择不同的荧光滤光片。

4. 将待检标本置于载物台上。

5. 用10×物镜对焦点，根据使用者的眼间距调节双目镜筒的间距。

6. 调节粗调和微调使标本至最清晰。

7. 拔出活动杆，使光路通过CCD至显示器。

8. 保存图象至电脑中。

9. 使用完毕后关掉电源，如镜头上有指纹或污迹用擦镜纸将其擦除。

10. 登记使用情况。

Nikon 80i主要技术参数：放大倍数40-1000，CFI60无限远光学系统，内置滤色镜，数字成像头。明场、暗场、简单偏光、 荧光/明场、荧光/暗场。波长：330-380，450-490，510-560。主电压90~250V。频率：50~60HZ。功率消耗：最大160W。周围环境温度：10~36℃。相对湿度：0~80%。污染级别：2。

荧光siRNA产品使用说明

RN：R11077.1

产品简介

荧光标记的siRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。荧光标记的siRNA转染细胞后，可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。荧光标记的

siRNA还可用作追踪siRNA在胞内的定位及分布的情况。

运输保存

产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。 表1 20μM储存液的配置参考 siRNA(nmol) 1 5 10 溶解体积(μl) 50 250 500

注：所有过程请注意避光！

使用方法

使用前须知

1）我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。 表2 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光 Dye Max Excitation Max Emission

FAM 492 518

Cy3 550 565

Cy5 649 680

2）请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。 3）储存、使用过程中及检测过程中请注意避光。 4）检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。

1，转染 具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。 以下为以riboFectTM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例：

a. 稀释siRNA：用50μl 1X riboFectTM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。 b. 混合液制备：加入5μl riboFectTM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。 c. 将riboFectTM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。 d. 将细胞置于培养箱中正常培养。 2，检测 可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可获得图像以分辨假阳性，使用流式细胞仪检测可快速得到转染率，减少多次拍照和计数的操作。 检测时间点：按转染试剂要求弃掉转染液更换为新鲜培养基的时间点上检测，或者其它合适的时间点。

细胞sirna转染操作流程

细胞siRNA转染操作流程

一、引言

近年来，细胞siRNA转染技术在生物医学领域中得到了广泛的应用。该技术通过靶向靶标基因的mRNA，使用小干扰RNA (siRNA) 来沉默特定基因的表达，从而研究基因功能及其在疾病中的作用。本文旨在介绍细胞siRNA转染的操作流程。

二、实验材料和设备

1. 细胞培养基：含有适当的营养物质和补充物的培养基。

2. 细胞培养器具：细胞培养板、离心管、培养皿等。

3. siRNA转染试剂：包括转染试剂和转染缓冲液。

4. 离心机

5. 显微镜

6. 实验室安全设备：如实验室无菌操作台、手套、护目镜等。

三、细胞处理

1. 培养细胞：将所要研究的细胞株在适宜的培养条件下培养至合适的生长状态。

2. 细胞传代：当细胞达到足够密度时，使用适当的方法将细胞传代到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态。

四、siRNA转染操作 1. 转染试剂配制：按照转染试剂说明书的要求，将转染试剂稀释至适宜的浓度。

2. 转染试剂与siRNA混合：将所需转染试剂与合适浓度的siRNA混合，使其充分结合。

3. 细胞转染：将混合好的转染试剂和siRNA溶液滴加到培养皿中的细胞上。

4. 转染时间：根据实验需要，确定转染时间，并在转染后的适当时间点进行下一步实验操作。

5. 细胞处理：根据实验目的，对转染后的细胞进行相应的处理，如培养、药物处理等。

6. 细胞观察：使用显微镜观察转染细胞的形态变化、细胞数量等。

五、结果分析

1. 蛋白检测：使用Western blot或免疫荧光技术检测转染后的细胞中目标蛋白的表达情况。

2. mRNA检测：使用RT-PCR或原位杂交等技术检测转染后的细胞中目标基因的mRNA水平。

3. 细胞功能分析：根据实验需要，进行细胞增殖、凋亡、迁移等功能分析实验。

六、讨论与展望

细胞siRNA转染技术是一种有效的基因沉默方法，可以用于研究基因功能和疾病机制。然而，该技术仍面临一些挑战，如选择合适的siRNA序列、提高转染效率等。未来的研究将致力于改进siRNA转染技术，以提高其应用的稳定性和可靠性。

siRNA转染方案

-向六孔板的每个孔种植2 x 10^5个细胞，每孔加入2ml不含抗生素的培养基

注意： 这个方案是针对六孔板中的一个孔，根据孔或皿的大小决定细胞和试剂的量。

-在含有CO2的37° C孵箱中培养细胞至60-80%融合。这大概需要18—24小时。

注意：健康和不完全融合的细胞对于成功转染试验是必要的。建议转染前一天要确保细胞存活。

-准备以下溶液：

溶液A： 每次转染，稀释2-8 μl siRNA duplex（例如 0.25-1μg 或20-80pmol siRNA）至100 μl siRNA转染基sc-36868

溶液B： 每次转染，稀释2-8 μl siRNA转染试剂sc-29528至100 μl siRNA转染基sc-36868。6 μl

siRNA 转染试剂可达高峰反应

注意：不要向siRNA转染基sc-36868内添加血清和抗生素

注意：最佳siRNA转染使用量对于不同目标蛋白是不同的，需通过实验来决定

注意：如果需要低浓度siRNA，可用siRNA稀释缓冲液sc-29527稀释 注意：尽管siRNA 转染试剂sc-29528对很多细胞系都是高效的，但可能不适用于所有细胞

-直接将溶液A加入溶液B，然后用吸管上下轻柔吹打，室温下孵育15-45分钟

-用2ml siRNA转染基 sc-36868清洗细胞一次，吸出转染基立即进入下一步骤

-每次转染，向溶液A和溶液B混合液中加入0.8ml转染基。轻柔混合后用混合液覆盖冲洗过的细胞

-将细胞放在含CO2的37℃孵箱孵育5-7小时

注意：有些细胞可能需要长时转染。然而长时血清饥饿可能会导致细胞分离或凋亡。

注意：结合了荧光素的对照siRNA只能在含CO2的37℃孵箱孵育5-7小时，孵育结束后利用荧光显微镜检测

-加入1ml两倍血清浓度和抗生素浓度的正常培养基(2x正常培养基)，不要移除转染混合液。如果有细胞毒性，移除转染混合液，用1x正常培养基替代