siRNA 使用说明

siRNA说明书

产品以冻⼲粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20 C?-80 'C保存，冻⼲粉可以稳定保存⼀年。

使⽤前请瞬时离⼼，⽤RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻

融（尽量不超过5次）。

表120 gM储存液的配置参考

使⽤前须知

为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使⽤完毕后请于-20 C~-80 C⼩⼼保存。

细胞实验⽅法

为了降低细胞密度、试剂⽤量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，⼀般建议：a. 转染实验中每个转染样品⾄少设置3个以上复孔；

b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持⼀致，并且细胞在各孔的表⾯平均分布。

1. 转染浓度：

siRNA产品最佳⼯作浓度因不同的细胞类型及研究⽬的⽽异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时

间为24?72h。最佳转染效率⼀般通过设置时间曲线和浓度梯度进⾏优化，优化的范围建议为5~100nM。2. 转染步骤：

以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染

请参考表2。1）转染前⼀天，接种适当数量的细胞⾄细胞培养板中，每孔中加⼊不含抗⽣素的培养基，使转染时的细胞

密度能够达到30~50%（不同细胞⽣长速度不⼀样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之⼀，细胞⽣长过度会削弱细胞活⼒，降低细胞的转染效率。2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：

a. 稀释siRNA :⽤50 g 不含⾎清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;

b. 稀释Iipo2000 :⽤50 g不含⾎清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;

荧光siRNA产品使用说明

RN：R11077.1

产品简介

荧光标记的siRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。荧光标记的siRNA转染细胞后，可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。荧光标记的

siRNA还可用作追踪siRNA在胞内的定位及分布的情况。

运输保存

产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。 表1 20μM储存液的配置参考 siRNA(nmol) 1 5 10 溶解体积(μl) 50 250 500

注：所有过程请注意避光！

使用方法

使用前须知

1）我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。 表2 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光 Dye Max Excitation Max Emission

FAM 492 518

Cy3 550 565

Cy5 649 680

2）请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。 3）储存、使用过程中及检测过程中请注意避光。 4）检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。

1，转染 具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。 以下为以riboFectTM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例：

a. 稀释siRNA：用50μl 1X riboFectTM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。 b. 混合液制备：加入5μl riboFectTM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。 c. 将riboFectTM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。 d. 将细胞置于培养箱中正常培养。 2，检测 可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可获得图像以分辨假阳性，使用流式细胞仪检测可快速得到转染率，减少多次拍照和计数的操作。 检测时间点：按转染试剂要求弃掉转染液更换为新鲜培养基的时间点上检测，或者其它合适的时间点。

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前请瞬时离心，用RNase-freeH2O或者灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融(尽量不超过5次)。

表1?20μM储存液的配置参考

溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000

使用前须知

为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法

为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：

a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；

b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

1.转染浓度：

siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。

2.转染步骤：

以lipofectamine?2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。

1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。

2)对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1.25μl20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；

Lipo8000转染

一、实验材料：

完全培养基、opti-Mem、Lipo8000（碧云天）

二、实验方法：

a. 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的 细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。

b. 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)。对于 Lipo8000™转染试剂，抗生素的存在不会影响转染效率，也不会在细胞转染后导致细胞毒性。

c. 参考下表，取一个洁净无菌离心管，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，加入125µl不含抗生素和血清的DMEM培 养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM®

Medium，加入2.5µg质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4µl Lipo8000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。配制完成后，室温存放6小时内稳定。

注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Lipo8000™可在2-6μl范围内进行适当调节，DNA建议固定在 2.5μg，但也可以在1-4μg的范围内进行适当调节。

注2：质粒的浓度宜控制在0.5-5μg/μl范围内。

注3：对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况，可以把每个孔所需的Lipo8000™转染试剂和DNA按照相应倍数加大用量，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。

注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核 苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。

d. 无论贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔125µl Lipo8000™转染试剂-DNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随 后轻轻混匀。