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PCR技术在临床检验中的应用生物技术支持医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。
60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。
特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。
用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。
一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。
另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。
本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。
这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。
常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。
消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。
引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。
这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。
我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。
乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。
通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。
有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。
例析几种与pcr技术应用相关的教学疑难点PCR技术是现代生物技术中应用广泛的一项技术，它可以在短时间内扩增DNA的特定片段，从而在基因检测、分子诊断和遗传工程等方面发挥重要作用。
在教学中，涉及PCR 技术的教学疑难点有以下几点：1. PCR反应体系的组成和作用原理PCR反应体系通常由DNA模板、引物、核酸聚合酶、dNTPs和缓冲液等组成。
在PCR反应中，引物通过与DNA模板特异性结合，引导聚合酶沿着模板链进行DNA合成，从而扩增目的片段。
其中，核酸聚合酶是PCR反应的最关键的组成部分之一，不同种类的核酸聚合酶具有不同的适用范围和特性，因此在PCR实验中需要选择适宜的核酸聚合酶。
此外，各组成部分之间的比例、反应温度、反应时间等因素也会影响PCR反应的结果。
2. 引物设计的原则和方法引物是PCR扩增中必不可少的关键元素之一，为确保PCR反应的特异性和高效性，设计合适的引物非常重要。
在引物设计中需要考虑多方面因素，如引物长度、碱基组成、引物间的距离、引物与靶序列的互补性等等。
在实际操作中，可以使用在线或离线的引物设计工具进行引物设计，同时也需要通过反应体系的优化来确认引物的特异性和选择性。
3. 操作中的污染与失真问题PCR反应系统对于污染和失真非常敏感，环境污染、试剂污染等均可能导致PCR反应失真或失败。
因此，在操作中需要特别注意反应系统和操作环境的净化和消毒，同时使用防污染工具和试剂也是提高PCR反应成功率的重要保障措施。
4. PCR检测结果分析及验证PCR实验得到的结果需要进行分析和验证，这是判断PCR反应成功否的关键环节。
常见的PCR检测结果验证方法有电泳分析、DNA序列分析、荧光探针PCR等。
在实际应用中，也需要结合临床数据或其他检测方法进行综合分析和判断，更为准确地判断检测结果。
pcr技术在实际生活中的应用
1、疾病的早期诊断，许多病原体的免疫学检测存在较长的窗口期，不利于疾病的早期诊断，PCR技术直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短窗口期，有利于疾病早期诊断。
2、肝炎病毒定量检测，PCR技术可提高检测的灵敏度和特异性，有利于早期诊断、分型鉴定、疗效监测、耐药基因分析等方面。
3、性病病原体的检测，在诊断中具有快速、特异、敏感的优点，对无症状和症状轻者可早期确诊，并可用于分型，用药指导。
4、新型冠状病毒检测，PCR技术可用于新型冠状病毒的早期检测，对无症状患者具有重要意义。
pcr技术在新冠病毒检测中应用的优缺点
核酸检测：以病原体核酸为目标的临床检测方法很多，包括测序法（一代，二代，单分子）、荧光PCR法、等温扩增法等，每种方法里的技术路线又有很多种，几乎所有核酸检测都包括了核酸扩增和信号获取这两步，这里不展开讨论不同技术路线的具体细节。
由于测序法检测时间长，不适合病原体的临床快速检测。
目前在新型冠状病毒核酸检测的试剂盒中采用了以PCR扩增为原理的荧光PCR法和以等温扩增为原理的恒温扩增芯片法。
两种检测方法比较：（1）准确性：荧光PCR法试剂可实现多重PCR 反应，在同一反应体系中增加内源性控制，可以对取样和核酸提取实现监控，增加检测结果的准确性。
而目前的等温扩增技术还不能实现多重反应，在同一检测体系中无法对检测样本质量和样本处理实现监控。
另外，等温扩增容易产生非特异性反应，造成假阳性；（2）检测时间：加上样本处理时间，荧光PCR法可以在4小时内完成检测，等温扩增法可以在1.5-2小时内完成检测；（3）敏感性：虽然二者的检测敏感性都达到了非常高的水平，但等温扩增法的敏感性更高一些，但也更易造成假阳性；（4）特异性：荧光PCR法更高一
抗原检测：基于抗原与抗体特异性结合的免疫学原理检测病人体内的病原体抗原，是近几年发展起来的病原体临床诊断方法，主要采用免疫荧光法。
通过高特异性的一级抗体标记固定的生物样本，再由标记荧光素的二级抗体产生荧光信号，在荧光显微镜下观察判断是否有病原体。
这种方法的特异性与一级抗体的特异性密切相关，检测时间短，通常一小时内能完成，敏感性较高。
筛选高特异性的抗体往往需要长时间的研发过程。
目前还没有新型冠状病毒的抗原检测试剂。
pcr技术在实际生活中的应用
PCR技术（聚合酶链反应）是一种在实验室中广泛应用的分子生物学技术，它在现实生活中有着广泛的应用。
本文将介绍PCR技术在医学、环境科学和犯罪侦查等领域中的应用。
PCR技术在医学领域中被广泛应用。
通过PCR技术，医生可以快速准确地检测出一系列疾病，如艾滋病、乙肝、结核病和新型冠状病毒等。
与传统的病原体检测方法相比，PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优势，可以迅速鉴定出病原体的存在，有助于早期诊断和治疗。
PCR技术在环境科学领域也有着重要的应用。
例如，在水质监测中，通过PCR技术可以检测出水体中的各种细菌、病毒和寄生虫等微生物，从而评估水质的安全性。
此外，PCR技术还可以用于检测土壤中的有害物质和重金属污染物，帮助环境科学家评估土壤的健康状况并制定相应的治理措施。
PCR技术在犯罪侦查中也发挥着重要作用。
通过PCR技术，可以从犯罪现场提取到微量的DNA，并对其进行扩增和分析。
这样可以确定嫌疑人的身份，帮助警方解决一系列犯罪案件。
PCR技术的高灵敏度和高特异性使得它能够快速准确地分析DNA样本，为犯罪侦查提供有力的科学依据。
PCR技术还在生物学研究中得到广泛应用。
例如，在基因工程领域，
PCR技术可以用来扩增和克隆DNA片段，从而进行基因定位、基因测序和基因重组等研究。
PCR技术在医学、环境科学和犯罪侦查等领域中都有着广泛的应用。
通过PCR技术，我们可以更快速、准确地进行疾病诊断、水质监测、犯罪侦查和基因研究等工作。
随着技术的不断发展和完善，相信PCR技术将在更多领域中发挥更大的作用，为人们的生活和健康保驾护航。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
pcr技术在新冠病毒检测中应用的优缺点
目前主要利用PCR技术来进行新冠病毒(RNA病毒)的核酸检测。
首先，将这个独一无二的核酸序列(RNA片段) 选出来，然后进行逆转录(RNA变成了DNA)，接着进行大量复制(扩增)，把这种独一无二的特性进行放大，就可以轻松检测新冠病毒。
如果单从技术方法的特异性和敏感性来看，目前第二代实时荧光定量PCR技术相对是最佳的。
患者新型冠状病毒核酸载量和抗体IgG/IgM的变化是一个动态过程，二者并不同步，这也决定了新型冠状病毒检测试剂在疾病不同发展阶段的有效性。
最近Lancet Infections Disease发表中国研究团队在病人在发病进程中的病毒载量的研究成果（见下图）。
通过核酸检测，研究团队分析了新型冠状病毒不同感染阶段的80例感染者的呼吸道样本，结果表明，在出现症状后的前几天病毒载量最高（-1到第9天）。
根据国家医疗器械审评中心，目前抗原/抗体检测试剂的灵敏度和特异性有限，不能作为新冠肺炎确诊和排除的唯一依据，不适用于一般人群的筛查，仅可作为已有病毒核酸检测试剂的补充。
产品预期用途建议限定于对核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标，或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。
通过核酸、抗原和抗体多种检测方式联
合应用，缩短检测窗口期，提高阳性检出率，在新冠肺炎的辅助诊断方面，具有十分重要的作用。
PCR应用中存在的问题
肖生祥（西安医科大学第二临床医学院皮肤科，710004）
开展PCR 应具有一定的条件。
需要一个正规的pCR 实验室，采集标本、核酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行；需有严密的防污染措施、假阳性和假阴性结果的质控等。
实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能，能够及时发现和纠正实验中的问题。
目前，我国在PCR 应用中尤其是在临床诊断中存在问题较多，主要表现为：PCR 试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低。
PCR 的应用范围过宽等，因此造成PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性结果。
一、假阳性：
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。
常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA 抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
预防措施：(1)工作区隔离。
(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。
(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。
交叉污染的处理方法：交叉污染指扩增产物对将要扩增的样品或反应管的污染。
由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。
交叉污染的处理方法包括[1]：
1 ．在DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR 产物。
一般选用波长254nm 照射30min （Nature ，1990 ，34:27 ）
2 ．PCR 实验中使用dUTP ，而不用dTTP 。
在扩增前使用UraciI N 一g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR 产物，而不降解基困组DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene ，1990 ，9
3 ：125 ）。
美国PE 公司提供此类试剂盒（PCR carry-over preventionkit 。
3 ．在PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA 链，使之不能再扩增（Nucleic Acids Res ，1991 ，19 ：99 ）。
二、假阴性：
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。
但这里应注意，许多国产PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒DNA ，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。
造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。
(2) DNA 样品中含有Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、DMSO 、SDS 等物质，可抑制Taq 酶活性，DNA 样品中的蛋白质和
重金属离子等亦影响Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性[2]。
设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。
在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。
三、PCR产物的鉴定
PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。
严格说来，PCR 产物均应通过实验证实其特异性。
在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。
综上所述，PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高[9] 。
目前的关键问题是如何正确应用PCR 。
虽然PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展PCR 需要的条件，PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。
目前，只有针对PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用PCR ，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。
参考文献
[1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992,
252:1643.
[2] 叶顺章，聚合酶链反应在性病诊断中的应用，中华皮肤科杂志，1996 ，29/p>
[3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr, 1995,53(4):155。
