PCR技术介绍PPT课件

格式：ppt
大小：2.32 MB
文档页数：13

下载文档原格式

PCR技术教程PPT课件

Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
第10页/共71页
特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
第5页/共71页
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循环
56℃ 72℃
退火延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析的方法。

pcr技术课件

数据处理
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退火、延伸等温度循环，以提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得最佳的pcr扩增效果，镁离子浓度过高或过低都可能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递遗传信息，确保遗传信息的稳定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理，通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实现高通量、高精度的核酸分子检测和分析，有助于深入研究和理解基因组学和转录组学等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微生物，在食品安全、环境保护和疾病控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物样本的来源，在犯罪调查和法庭科学中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、引物、dNTPs和耐高温的DNA聚

pcr培训课件ppt

遵循标准化操作流程，确保实验的一致性和准确性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物，在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产物进行测序，以确定其序列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和可比性。

pcr ppt课件教程

引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度，通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合，为聚合酶提供起始点。

pcr技术课件ppt简短

通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如血液、组织等，以便后续实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或荧光定量PCR等检测方法，确定目标基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。

PCR详细讲解PPT课件

2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。
2021/3/7
CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。
2021/3/7
CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
2021/3/7
CHENLI
9
中温延伸
2021/3/7
CHENLI
10
2021/3/7
CHENLI
11
2021/3/7
CHENLI
12
2021/3/7
CHENLI
13
• 理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。

pcr技术PPT课件

课题2
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱氧磷酸
脱氧
核苷
核糖脱氧核苷
腺嘌呤（A）嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基嘧啶胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重氢化钾等
氘、氚聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发生了裂变。
（2）裂变产物多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
n
→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。

PCR专题 ppt课件

pre-denaturation-denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应： • X=X0*2n •非理想的PCR反应： • X=X0 (1+Ex)n • • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
PCR process
Principle of PCR

生物检测技术-PCR技术PPT

引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高，对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量要求较高，样品中微小的杂质或污染

PCR技术简介-PPT课件

2 ul
4 ul 2 ul 0.4ul 0.4ul 0.4ul 3.8ul 1 ul 1 ul 5 ul
RT-PCR反应体系
两步法RT-PCR
Components
Volume(µ l)
Components
RNA 5xR.T.buffer dNTPs(10mmol/L)
Primer Rnasin(50U/µ l) AMV-RT((10U/µ l)
目的基因的克隆基因的体外突变生成大量DNA以进行序列测定特异基因表达量分析
PCR反应体系
20ul；25ul；50ul
10× PCR Buffer Mg2+ dNTPs 引物1 引物2 模板 Taq酶 ddH2O
浓度
1.5mmol/L 200umol/L
10pmol 10pmol 0.1～2ug
PCR实验准备--仪器、耗材
PCR仪移液器吸头 200ul PCR管反应程序
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性低温退火适温延伸
DNA 2
形成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上
Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通常4 l/50 l ） Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、 PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性
PCR实验准备—试剂

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

C. 延伸的温度与时间
温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃）
D. 循环数
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次）
.
02 基本实验步骤
PCR产物检测
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶板的制备(1.5%)
加样电泳（电压80V、时间2hr）
紫外
EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光
熔解曲线确认PCR反应的特异性。
.
Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
.
PCR
谢谢观看
Thanks
.
耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃）
形成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
.
02 基本实验步骤
核酸模板引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子 PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5µM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等
PCR
多聚酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
.
01 原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA 合成
.
01 原理
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性低温退火适温延伸
荧光探针法
.
Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
这样的直线即基线。
。
光阈值（threshold）
一般将PCR反应前15个循环的荧光信
号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR
3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧
光域值设定在PCR扩增的指数期
.
03 衍生PCR技术
原位PCR
逆转录PCR
PCR技术
定量PCR
.
巢式PCR 多重PCR
逆转录 PCR
相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA →cDNA合成，是单链到双链的过程。
引物逆转录酶
RNA水解酶
.
Real Time qPCR
荧光嵌合法(TB Green™)
实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Ct (Cycle threshold)值
表示每个PCR反应管内荧光信号到达
设定的域值时所经历的循环数 .
Real Time qPCR
Ct值无数值（undetected）阴性
Ct值≤30.0 阳性
Ct值>30.0 表达量极少
固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。