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《CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究》篇一CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究一、引言随着基因编辑技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统已经成为生物学研究的重要工具之一。
这种系统在许多生物学应用中展现出其独特的优势，特别是在人类基因治疗的开发上。
近年来，CRISPR/Cas9技术在成纤维细胞中的定点整合研究中显示出广阔的前景，其中对具有医学价值基因片段如人胰岛素（hINS）的精准调控成为关注的焦点。
本论文研究重点即通过CRISPR/Cas9技术介导人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中实现定点整合。
二、研究方法本实验主要运用了CRISPR/Cas9系统来将人胰岛素（hINS）基因精准整合到牛成纤维细胞中。
具体操作包括构建合适的CRISPR/Cas9表达载体，筛选和编辑目标细胞，并使用特定的荧光标记来验证基因的整合效果。
（一）载体构建我们设计并构建了包含人胰岛素（hINS）基因序列的CRISPR/Cas9表达载体。
该载体包含Cas9蛋白编码序列、引导RNA（gRNA）以及hINS基因序列。
（二）细胞编辑将构建好的载体通过电转或病毒转导的方式导入牛成纤维细胞中，通过CRISPR/Cas9系统对细胞进行编辑，实现hINS基因的定点整合。
（三）验证整合效果通过荧光显微镜观察细胞的荧光标记情况，以及利用PCR和测序技术验证hINS基因的整合情况。
三、结果与讨论（一）实验结果通过CRISPR/Cas9系统的编辑，我们成功实现了人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中的定点整合。
在荧光显微镜下，我们观察到成功整合了hINS基因的细胞呈现出明亮的荧光。
此外，PCR和测序结果表明，hINS基因已成功整合到牛成纤维细胞的基因组中。
（二）讨论本实验结果表明，通过CRISPR/Cas9技术介导的hINS基因定点整合是可行的。
心脏纤维化发病机制及治疗的研究进展李阳;步睿;王晓云【摘要】心血管疾病(CVD)是世界范围内导致死亡的主要原因之一,而心脏纤维化几乎与所有的心血管疾病都有密切关系,尤其是心肌梗死和心力衰竭.纤维化本身是创伤愈合和组织修复的一种适应性反应,然而,它的持续激活是非常有害的,可以使心脏发生结构改变和功能衰竭而导致死亡.但目前尚无有效的治疗方法来逆转纤维化的进展,反映了对心肌纤维化机制认识的不全面,如果可以更好的认识心脏纤维化的发生机制,将有助于探索新的治疗方法来干预纤维化的发生、发展.本文旨在在心脏纤维化病理生理学基础上,总结目前心脏纤维化主要的细胞和分子机制及治疗的相关研究进展.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2018(047)012【总页数】3页(P9-11)【关键词】心脏纤维化;发病机制;治疗【作者】李阳;步睿;王晓云【作者单位】150001 哈尔滨医科大学附属第四医院;150001 哈尔滨医科大学附属第四医院;150001 哈尔滨医科大学附属第四医院【正文语种】中文【中图分类】R543心脏纤维化最初被认为是一种适应性的保护机制，然而随着时间的推移发现纤维化可导致不可逆的心室重塑，显著损害心脏功能。
随着人口的老龄化加剧，心脏纤维化相关的心血管疾病(cardio vascular diseases,CVD)的发生率和病死率不断上升，降低CVD患者的生活质量，增加医疗花销。
因此，如有可以对心肌纤维化机制有更明确的认识，将提高对于心肌纤维化的认识和治疗进程。
一、心脏纤维化的概述心脏纤维化是指各种原因所致的细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)成分在心脏的过度产生和沉积导致心脏发生严重的瘢痕化、组织僵硬和功能受损。
心肌细胞的损伤和死亡导致心脏结构和功能的缺陷，心脏组织必须在细胞水平上重塑以满足人体的生理需求。
心肌细胞的缺血和死亡激活了心脏的急性修复传导通路，该修复过程可以分为两个阶段。
不同人体细胞外泌体的特点及功能化研究-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：外泌体（exosomes）是一种活细胞分泌的囊性小泡，能携带脂质、蛋白质和遗传物质，在体内进行生物信息传输。
外泌体中独特的组织或细胞特异性蛋白质和遗传物质，可反映其细胞来源和细胞的生理状态，因此不同细胞来源的外泌体有不同的特点和功能。
基于其内源性、生物相容性和多功能特性，外泌体有望成为药物递送系统、免疫治疗、精准治疗的新手段。
本综述聚焦近年来报道的不同细胞分泌的外泌体的特点及功能化研究成果，对其进行归纳总结。
关键词：外泌体; 细胞来源; 药物递送载体; 疾病治疗;Abstract：Exosomes,cystic vesicles secreted by living cells,carry lipids,proteins and genetic materials,and transmits biological informations in the body. The unique tissue or cell-specific proteins and genetic materials in the exosomes generally reflect the cell origin and the physiological state of cells,so the exosomes from different cell sourcesappear to have different characteristics and functions. In view of the endogenous character,biocompatibility and functional versatility,the exosomes are expected to be a new means for the drug delivery systems,immunotherapies,and precision treatment. This review summarizes the exosomes secreted by different cells,focusing on the research achievement in their characteristics and functionalization studies in recent years.Keyword：exosomes; cell sources; drug delivery vehicles; disease treatment;外泌体（exosomes）是活细胞吞噬异源物质后以出芽方式向内凹陷形成含有多个小泡的多泡体（multivesicular body,MVB），再由多泡体与细胞膜融合而释放的小囊泡（图1）。
绿色荧光蛋白（GFP）在生命科学中的应用生命科学学院2011级2011012911 姜悦绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，最早是从华盛顿维多利亚水母体内克隆得到的。
GFP本身具有发光功能的荧光基团，无需特殊的辅助因子或其他蛋白的参与。
在近几年的生命科学研究中，GFP已经成为跟踪活组织或活细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，这一方法日益成熟，成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。
GFP在组织中表达产生内在的荧光，从而可以标记一些正常的细胞学过程，再借助一些高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控这些动态过程。
一、GFP基因作为报告基因在生命科学中的应用GFP基因是一种标志基因，带有该基因的物种会发生荧光反应。
GFP基因往往与其他物种的功能基因一起植入实验物种的细胞，转基因得到的新物种如果出现荧光反应，则与GFP基因同时植入的其他物种的基因也应该存在于转基因物种的细胞内。
《海洋科学》2011年第35卷第9期报道的《杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析》（谷辉辉，冯书营，潘卫东，李杰，薛乐勋）中就利用GFP基因作为一种报告基因。
目前, 虽然已经利用盐藻的核转化系统表达了一些外源基因，但是外源基因在细胞核转化时容易发生基因沉默、表达量低等现象，为此，研究者进行了转化盐藻叶绿体而非转化细胞核的尝试。
研究者采用DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、SmaI 和StuI六种内切酶消化杜氏盐藻叶绿体基因组DNA，与相应DNA接头连接, 构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。
利用长距离PCR技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位基因上游序列1347bp。
启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征，根据这些特征设计引物，扩增4个5′端系列缺失的启动子片段，并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建启动子5′端系列缺失重组质粒，以期鉴定不同启动子片段驱动报告基因转录的活性。
腺病毒转染细胞步骤及方法腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al., 1998a,b）。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。
运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。
二、腺病毒载体优势1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达；3)包装外源基因的片段大，高达8kb；4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。
三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15 天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000 rpm 离心10 分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A 细胞中测定并标定病毒滴度。
在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。
四、具体步骤细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/ml （一般稀释倍数为100 倍），在0.1 ml 的细胞悬液中加入0.1 ml 的0.4%的台盼蓝溶液。
大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达刘安娜;王佐林【摘要】目的:构建表达大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的重组腺病毒载体,并观察其感染人胚肾293AD(human embryo kidney 293AD,HEK293AD)细胞后OPN的表达.方法:提取大鼠骨组织总RNA,利用反转录聚合酶链式反应(reversal transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增目的片段,将产物双酶切后连入腺病毒穿棱质粒载体中,构建pacAd5 CMV-IRES-GFP-OPN.PCR及双酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架载体pacAd5 9.2-100同时经Pacl酶切,利用HEK293AD细胞进行包装、生产,构建出重组腺病毒.通过HEK293AD细胞绿色荧光表达反映重组腺病毒的表达情况,并用RT-PCR检测OPN的表达.结果:成功构建了携带OPN 的重组质粒,脂质体介导下转染HEK293AD细胞,7d后可见明显的荧光表达,12d后有半数细胞飘起,收集原病毒液感染的293AD 细胞后,实验组OPN的表达明显高于对照组细胞,24h感染效率为15％,36 h感染效率为21％.结论:利用腺病毒载体系统RAPAD成功构建了含OPN基因的重组腺病毒载体,为进一步研究OPN对皮肤创口愈合的影响提供了一定的实验基础.%Objective: The study was designed to construct a reeombinanl adenovims vector containing rat osteopontin (OPN) by RAPAD vector, and to study its expression in human embryonic kidney 293AD (HKK293AD) cells. Methods: The OPN cDNA was obtained by RT-PCR amplification from rat bone tissue, and then inserted into pacAf]5 CMV-IRES-CFP shuttle vector. The plasmid was checked and verified by digestion and UNA sequence analysis, then it and pacAd5 9.2-100 Vector were linearized by Pad. The recombinant adenovirus was transfecled into HER293AD cells for packaging and amplification. Result:The recombinant adenovirus vector containing OPN gene was constructed successfully in vitro and OPN gene expression was increased significantly in HEK293AI) cell after infection by the recombinant virus. Conclusion: The recombinant adenovirus vector containing OPN gene was constructed successfully in vitro. It may be a useful tool for the research on the OPN gene.【期刊名称】《口腔颌面外科杂志》【年(卷),期】2012(022)004【总页数】5页(P233-237)【关键词】骨桥蛋白;腺病毒载体;质粒重组;基因克隆【作者】刘安娜;王佐林【作者单位】同济大学口腔医院口腔颌面外科,上海200072;同济大学口腔医院口腔颌面外科,上海200072【正文语种】中文【中图分类】R782.2;Q78骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种具有多种生物活性的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，其相对分子质量为4.15×104。
Sfrp-1通过下调Wnt信号对血管紧张素Ⅱ相关心肌损伤的影响严宪才,李亮,吴志光,刘锦文,冯劲立,杨宇琦,周耀辉摘要:目的观察分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)调控无翼相关整合位点(Wnt)信号通路对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体外心肌细胞损伤的影响㊂方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2,设置空白对照组(control组)㊁9型腺相关病毒载体组(aav9-Sfrp1组)和无Sfrp1基因组(aav9-NC组);control组仅进行常规培养,aav9-Sfrp1组和aav9-NC细胞分别转染aav9-Sfrp1和aav9-NC后,使用AngⅡ诱导心肌肥大模型㊂采用细胞计数试剂盒-8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光对心肌细胞内LC3进行染色,蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白(Sfrp1㊁p62㊁atg5㊁Beclin1㊁LC3)和Wnt/β-catenin通路相关蛋白(β-catenin㊁Dvl-1㊁Wisp1)表达㊂结果: aav9-Sfrp1组Sfrp1mRNA表达水平高于aav9-NC组(P<0.01)㊂aav9-NC组细胞存活率低于control组,aav9-Sfrp1组细胞存活率高于aav9-NC组(P<0.01)㊂aav9-NC组细胞凋亡率高于control组,aav9-Sfrp1组细胞凋亡率低于aav9-NC组(P<0.01)㊂aav9-NC 组LC3荧光染色强度低于control组,aav9-Sfrp1组LC3荧光染色强度高于aav9-NC组㊂aav9-NC组p62㊁LC3Ⅰ/Ⅱ表达高于control组,atg5㊁Beclin1表达低于control组(P<0.05);aav9-Sfrp1组p62㊁LC3Ⅰ/Ⅱ表达低于aav9-NC组,atg5㊁Beclin1表达高于aav9-NC组(P<0.01)㊂aav9-NC组β-catenin㊁Dvl-1和Wisp1表达高于control组(P<0.001),aav9-Sfrp1组β-catenin㊁Dvl-1和Wisp1表达低于aav9-NC组(P<0.001)㊂结论:Sfrp1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,诱导细胞自噬,减轻心肌肥大,发挥保护心肌损伤的作用㊂关键词心肌肥大;心肌损伤;分泌型卷曲相关蛋白1;Wnt/β-catenin信号通路;细胞自噬;血管紧张素Ⅱ;实验研究d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2024.05.007Effect of Sfrp-1on AngiotensinⅡ-related Myocardial Injury by Down-regulating Wnt SignalingYAN Xiancai,LI Liang,WU Zhiguang,LIU Jinwen,FENG Jinli,YANG Yuqi,ZHOU YaohuiZhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine,Zhongshan528400,Guangdong, China,E-mail:******************Abstract Objective:To observe the effect of secreted frizzled related protein-1(Sfrp1)regulating wingless-related MMTV integration site(Wnt)on angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiomyocyte injury in vitro.Methods:Rat cardiomyocytes H9c2were cultured in vitro, and blank control group(control group),type9adeno-associated virus vector group(aav9-Sfrp1group)and non-Sfrp1gene group(aav9-NC group)were set up.The control group was only cultured routinely,aav9-Sfrp1group and aav9-NC cells were respectively transfected with aav9-Sfrp1and aav9-NC cells,and the myocardial hypertrophy model was induced by AngⅡ.Cell activity was detected by cell counting kit8,cell apoptosis was detected by flow cytometry,LC3in cardiomyocytes was stained by immunofluorescence.The expression of autophagy associated proteins(Sfrp1,p62,atg5,Beclin1,LC3)and Wnt/β-catenin pathway-associated proteins(β-catenin, Dvl-1,Wisp1)were detected by protein imprinting.Results:The mRNA expression level of Sfrp1in aav9-Sfrp1group was higher than that in aav9-NC group(P<0.01).The cell survival rate of aav9-NC group was lower than that of control group,and that of aav9-Sfrp1 group was higher than that of aav9-NC group(P<0.01).The apoptosis rate of aav9-NC group was higher than that of control group, and that of aav9-Sfrp1group was lower than that of aav9-NC group(P<0.01).The LC3fluorescence staining intensity of aav9-NC group was lower than that of control group,and the LC3fluorescence staining intensity of aav9-Sfrp1group was higher than that of aav9-NC group.The expressions of p62,LC3Ⅰ/Ⅱin aav9-NC group were higher than those in control group,while the expressions of atg5,Beclin1in AAV9-NC group were lower than those in control group(P<0.05).The expressions of p62,LC3Ⅰ/Ⅱin aav9-Sfrp1 group were lower than those in aav9-NC group,and the expressions of atg5,Beclin1in aav9-NC group were higher than those in AAV9-NC group(P<0.01).The expressions ofβ-catenin,Dvl-1and Wisp1in aav9-NC group were higher than those in control group(P< 0.001),and the expressions ofβ-catenin,Dvl-1and Wisp1in aav9-Sfrp1group were lower than those in aav9-NC group(P<0.001). Conclusion:Sfrp1could induce the cell autophagy,alleviate myocardial hypertrophy,and protect myocardium injury by inhibiting the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway.Keywords myocardial hypertrophy;myocardial injury;secreted frizzled related protein1;Wnt/β-catenin signaling pathway; autophagy;angiotensinⅡ;experimental study急性心肌梗死是致死率极高的心血管疾病之一,基金项目中山市科学技术局2021年第一批社会公益(医疗卫生一般项目)(No.2021B1057)作者单位广州中医药大学附属中山中医院(广东中山528400),E-mail: ******************引用信息严宪才,李亮,吴志光,等.Sfrp-1通过下调Wnt信号对血管紧张素Ⅱ相关心肌损伤的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2024, 22(5):811-816.是由冠状动脉急性阻塞㊁心肌缺血坏死引起的,多发生于45岁以上的中老年人群,若不及时治疗,可使心脏结构和功能受损,进而发展为急性心力衰竭,在短时间内导致死亡[1],严重威胁病人生命安全㊂现阶段临床多通过再灌注方式进行治疗,可能发生缺血再灌注损伤,影响治疗效果及预后[2]㊂心肌细胞凋亡是心肌重塑的重要标志,清除凋亡的细胞是治疗心力衰竭的重要过程[3]㊂随着分子技术的不断发展,细胞凋亡和自噬证实参与了心肌损伤过程,与细胞损伤修复和心功能保护作用有关[4]㊂无翼相关整合位点(wingless-related MMTV integration site,Wnt)信号通路与心血管疾病有关,参与心肌细胞肥大㊁主动脉狭窄㊁动脉粥样硬化等心脏生理病理改变[5]㊂分泌型卷曲相关蛋白1 (secreted frizzled related protein1,Sfrp1)与Wnt配体竞争性结合负调控Wnt信号通路,与心肌梗死等多种疾病的发生发展有关[6]㊂既往研究报道,Sfrp1具有较强的促血管新生作用,过表达Sfrp1的骨髓干细胞可抑制心肌梗死区中性粒细胞浸润,拮抗炎症反应,从而抑制心肌缺血损伤[7]㊂基于此,本研究采用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)体外诱导大鼠H9c2细胞构建心肌肥大模型,将9型腺相关病毒转染Sfrp-1至H9c2细胞中,探讨Sfrp-1调控Wnt信号通路影响细胞自噬对心肌损伤的影响,为临床治疗心肌肥厚㊁心肌损伤和心力衰竭提供实验依据,现报道如下㊂1材料与方法1.1实验材料大鼠心肌细胞系H9c2购自中国科学院上海细胞库,将H9c2细胞置于含10%胎牛血清和青霉素链霉素混合物的改良伊格尔培养基(DMEM)37ħ㊁5%CO2条件下培养,每日更换新的培养液,当细胞密度达到80%~90%时,以0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化后传代㊂设置空白对照组(control组)㊁9型腺相关病毒载体组(aav9-Sfrp1组)和无Sfrp1基因组(aav9-NC 组),control组仅进行常规培养,aav9-Sfrp1组和aav9-NC组按相关操作构建心肌肥大模型㊂1.2心肌肥大模型的建立取培养后的对数生长期大鼠H9c2细胞接种于6孔板中,设置每孔细胞密度为5ˑ105个,分别以重组9型腺相关病毒载体(aav9-Sfrp1)㊁无Sfrp1基因(aav9-NC)转染H9c2细胞,转染复数为6ˑ105(v.g.)/细胞㊂将病毒液完整覆盖于培养基中的细胞表面,保持37ħ㊁5%CO2条件,每隔30min摇晃培养基,使病毒充分接触细胞㊂转染5d后,以10-6mmol/L AngⅡ刺激H9c2细胞48h,诱导心肌肥大模型㊂1.3实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription,qRT-PCR)检测H9c2细胞内Sfrp1mRNA表达采用TRIzol试剂提取H9c2细胞内的总RNA,之后用PrimeScript TM RT试剂盒将mRNA逆转录成cDNA,用SYBR GreenPCR试剂进行显色, ABI7500FAST Real-Time PCR仪进行qRT-PCR㊂采用2-әәCt方法评估,以GAPDH作为标准化内参校正后Sfrp1mRNA表达水平㊂Sfrp1正向引物:5'-A TG-CAGTTCTTCGGCTTCT ACT-3';反向引物:5'-CAGCT-TCTTCAGCTCCTTCTTC-3'㊂1.4细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测细胞活力采用CCK8(上海语纯生物科技有限公司)检测各组心肌细胞H9c2的细胞活力,将细胞按每孔1ˑ105个密度接种于96孔板中培养48h,加入CCK8溶液再次培养2h,严格按照说明书进行操作,采用酶标仪检测波长450nm处各组细胞的吸光度值㊂计算细胞活力,细胞存活率(%)=(试验井平均吸光度)/(对照井平均吸光度)ˑ100%㊂1.5流式细胞术检测细胞凋亡将各组细胞重悬于缓冲区中,加入膜联蛋白V (Annexin V-FITC)试剂(上海博湖生物科技有限公司)和碘化丙啶(PI)染液(上海如吉生物科技发展有限公司),避光孵育15min后,采用流式细胞仪(上海三崴医疗设备有限公司)按照试剂盒说明书分析细胞凋亡情况㊂1.6蛋白免疫印迹法检测蛋白表达将各组细胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞溶解液中,收集细胞提取物,4ħ条件下离心15 min,二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(福州奥研实验器材有限责任公司)检测蛋白浓度,凝胶电泳分离蛋白质,电转移至膜后室温下封闭,4ħ条件下,与一抗Sfrp1㊁p62㊁atg5㊁Beclin1㊁LC3㊁β-catenin㊁Dishevelled-1 (Dvl-1)㊁WNT1诱导信号通道蛋白1(Wnt1-inducible signaling pathway protein1,Wisp1)㊁β-actin(上海艾博抗贸易有限公司)孵育过夜,室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1min,采用电化学发光(ECL)试剂(广州济恒医药科技有限公司)显影,Image J软件进行蛋白定量分析㊂1.7免疫荧光分析将上述处理的各组细胞室温下用4%多聚甲醛固定30min,用0.4%Triton X-100渗透1h,37ħ下以山羊血清阻断1h,与LC3一抗(上海艾博抗贸易有限公司)和硫氰酸荧光素标记的IgG二抗连续培养,奥林巴斯ckx53荧光显微镜(上海迪图生物科技有限公司)观察细胞免疫荧光情况㊂1.8统计学处理采用SPSS22.0软件进行数据分析,符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1各组Sfrp1mRNA表达水平比较aav9-Sfrp1组Sfrp1mRNA表达水平高于aav9-NC 组(P<0.05)㊂提示转染成功㊂详见表1㊁图1㊂表1各组Sfrp1mRNA表达水平比较(xʃs)组别Sfrp1mRNA/GAPDH control组 1.01ʃ0.13aav9-NC组 1.00ʃ0.09aav9-Sfrp1组 3.27ʃ0.35①F值104.345P<0.001注:aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,①P<0.001㊂图1各组Sfrp1mRNA表达水平比较的柱状图(aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,*P<0.001)2.2各组细胞存活率比较aav9-NC组细胞存活率低于control组,aav9-Sfrp1组高于aav9-NC组(P<0.01)㊂详见表2㊁图2㊂表2各组细胞存活率比较(xʃs)单位:%组别细胞存活率control组98.87ʃ10.23 aav9-NC组46.75ʃ5.73①aav9-Sfrp1组72.06ʃ6.94②F值32.932P<0.001注:aav9-NC组与control组比较,①P<0.01;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,②P<0.01㊂图2各组细胞存活率比较的柱状图(aav9-NC组与control组比较,*P<0.01;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,#P<0.01)2.3各组细胞凋亡率比较aav9-NC组细胞凋亡率高于control组,aav9-Sfrp1组低于aav9-NC组(P<0.01)㊂详见表3㊁图3及图4㊂表3各组细胞凋亡率比较(xʃs)单位:%组别细胞凋亡率control组 4.02ʃ0.47 aav9-NC组14.85ʃ1.26①aav9-Sfrp1组8.23ʃ0.85②F值105.988P<0.001注:aav9-NC组与control组比较,①P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,②P<0.01㊂图3各组细胞凋亡率比较的柱状图(aav9-NC组与control组比较,*P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,#P<0.01)图4各组细胞凋亡流式图2.4各组细胞免疫荧光强度比较aav9-NC组LC3荧光染色强度低于control组,aav9-Sfrp1组LC3荧光染色强度高于aav9-NC组㊂详见图5㊂图5各组细胞LC3免疫荧光强度图(50μm)2.5各组细胞自噬相关蛋白表达比较aav9-NC组p62㊁LC3Ⅰ/Ⅱ表达高于control组, atg5㊁Beclin1表达低于control组(P<0.05);aav9-Sfrp1组p62㊁LC3Ⅰ/Ⅱ表达低于aav9-NC组,atg5㊁Beclin1表达高于aav9-NC组(P<0.01)㊂详见表4㊁图6㊂表4各组细胞自噬相关蛋白表达比较(xʃs)组别p62/β-actin atg5/β-actin Beclin1/β-actin LC3Ⅰ/Ⅱ/β-actin control组 1.02ʃ0.11 1.01ʃ0.09 1.00ʃ0.11 1.01ʃ0.10 aav9-NC组 3.86ʃ0.32②0.35ʃ0.05②0.29ʃ0.03② 1.18ʃ0.12①aav9-Sfrp1组 1.21ʃ0.16④ 1.32ʃ0.15④0.88ʃ0.09③0.39ʃ0.04④F值161.92966.73461.60759.850P<0.001<0.001<0.001<0.001注:aav9-NC组与control组比较,①P<0.05,②P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,③P<0.01,④P<0.001㊂图6各组细胞自噬相关蛋白表达(A为各组蛋白表达条带图;B为各组蛋白表达柱状图㊂aav9-NC组与control组比较,*P<0.05,#P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,әP<0.01,&P<0.001)2.6各组细胞内Wnt/β-catenin通路表达比较aav9-NC组β-catenin㊁Dvl-1和Wisp1表达高于control组(P<0.001),aav9-Sfrp1组β-catenin㊁Dvl-1和Wisp1表达低于aav9-NC组(P<0.001)㊂提示Sfrp1可抑制Wnt/β-catenin通路活化㊂详见表5㊁图7㊂表5各组细胞内Wnt/β-catenin通路表达比较(xʃs)组别β-catenin/β-actin Dvl-1/β-actin Wisp1/β-actin control组 1.01ʃ0.130.99ʃ0.10 1.00ʃ0.12 aav9-NC组 3.16ʃ0.35① 2.78ʃ0.31① 2.69ʃ0.27①aav9-Sfrp1组0.96ʃ0.10② 1.13ʃ0.11②0.85ʃ0.09②F值95.03075.459100.399 P<0.001<0.001<0.001注:aav9-NC组与control组比较,①P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,②P<0.001㊂图7各组细胞内Wnt/β-catenin通路蛋白表达(A为各蛋白表达条带图;B为各蛋白比较的柱状图㊂aav9-NC组与control组比较,*P<0.001;aav9-Sfrp1组与aav9-NC组比较,#P<0.001)3讨论心力衰竭是心肌肥大等心肌损伤疾病的终末期表现,从分子角度分析,细胞凋亡与心肌肥大等心肌损伤密切相关,清除凋亡细胞是心肌肥大水平治疗的重要靶点[8]㊂AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮诱导心肌肥大和心肌细胞凋亡的效应肽,是诱导心肌肥大损伤模型的常用方式,通过刺激细胞间的分子转导㊁信号通路失活及活化,诱导心肌细胞表型改变[9]㊂本研究采用AngⅡ诱导大鼠H9c2心肌细胞建立心肌肥大模型,转染aav9-Sfrp1,探讨Sfrp1调控Wnt/β-catenin通路对心肌细胞损伤的影响㊂Sfrp1基因是Sfrp分泌糖蛋白家族的一员,在宫颈癌㊁乳腺癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中基因表达缺失[10],通过调控DNA甲基化和microRNA转录导致基因表观遗传沉默,抑制细胞增殖㊁迁移和侵袭,发挥显著的抑癌作用[11]㊂有研究显示,Sfrp1在心血管系统中发挥着重要作用,可保护因心肌梗死等造成的心脏损伤[12]㊂Sklepkiewicz等[13]研究显示,Sfrp1基因敲除小鼠随着年龄增长,心功能逐渐恶化,心肌纤维化水平加剧,可观察到明显的扩张型心肌病特征㊂本研究结果表明,转染Sfrp1可显著增强AngⅡ诱导的体外心肌细胞增殖活性,抑制细胞凋亡,诱导细胞自噬,发挥显著的保护心肌损伤作用㊂与Pan等[14]研究结果一致㊂Sfrp1对心肌细胞的调控作用可能通过影响Wnt/β-catenin信号通路实现的,Sfrp1是Wnt/β-catenin通路的重要抑制剂,Sfrp1通过抑制Wnt/β-catenin通路的活化,抑制α平滑肌肌动蛋白水平㊁胶原合成能力及心肌纤维化,促进成纤维细胞的激活[15],进而促进正常心肌细胞存活,增强细胞活性,抑制细胞凋亡并影响自噬㊂细胞自噬不同于凋亡的代谢过程,通过将细胞质中的物质传送至溶酶体中进行动态分解,清除受损㊁破裂及癌变的细胞,维持正常细胞和组织的稳态平衡㊂p62㊁Beclin1㊁atg5和LC3是细胞自噬的重要标志物[16]㊂LC3是由LC3Ⅰ和LC3Ⅱ组成的自噬相关蛋白,细胞自噬发生时,p62表达下调,Beclin1㊁atg5表达上调,LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合转化为LC3Ⅱ㊂Wnt/β-catenin通路是调控基因转录㊁细胞生长㊁发育及分化的重要信号通路,与心肌肥大㊁心力衰竭等心血管疾病的发生发展有关[17]㊂有研究显示,Wnt/β-catenin不仅与细胞增殖㊁迁移㊁侵袭和凋亡过程有关,还可激活下游效应分子Dvl-1㊁Wisp1,参与细胞自噬过程[18]㊂本研究结果显示,Wnt/β-catenin通路被Sfrp1基因抑制,诱导细胞自噬,促进心肌细胞存活,增强细胞活性,抑制细胞凋亡,在AngⅡ诱导的心肌肥大细胞模型中发挥着保护作用㊂Tao等[19]研究显示,Wnt/β-catenin 通路是老年小鼠心肌梗死的重要靶点,Sfrp1可靶向抑制Wnt/β-catenin通路活化,有效降低心肌纤维化程度,抑制心肌细胞凋亡,改善老年小鼠的心功能,保护心脏免受急性心肌梗死损伤㊂分析原因,可能与Wnt/β-catenin通路的生物特性有关,Sfrp1与Wnt的配体竞争性结合,导致Wnt/β-catenin通路的信号转导和活化被抑制,下游效应分子Dvl-1㊁Wisp1的表达显著下调,失活的Wnt/β-catenin通路可抑制血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖,增强心肌细胞活性,并通过线粒体凋亡㊁内质网应激及死亡受体等途径抑制细胞凋亡[20],诱导细胞自噬,从而缓解心肌细胞损伤㊂综上所述,Sfrp1通过使Wnt/β-catenin信号通路失活,降低了大鼠心肌细胞H9c2的体外凋亡,促进正常心肌细胞存活,增强细胞活性,诱导细胞自噬,从而发挥保护心肌细胞免受AngⅡ刺激引起的损伤㊂本研究揭示了Wnt/β-catenin通路在心肌损伤中的重要作用,并提出Sfrp1基因是保护心肌细胞免受AngⅡ诱导造成损伤的关键分子,为心肌梗死等心血管疾病的治疗提供了新的分子靶点和治疗策略㊂本研究存在一定的局限性,未验证Sfrp1调控Wnt/β-catenin通路是否发挥同样效应,今后需深入探索㊂参考文献:[1]SMIT M,COETZEE A R,LOCHNER A.The pathophysiology ofmyocardial ischemia and perioperative myocardial infarction[J].Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia,2020,34(9):2501-2512.[2]ROUT A,TANTRY U S,NOVAKOVIC M,et al.Targetedpharmacotherapy for ischemia reperfusion injury in acutemyocardial infarction[J].Expert Opinion on Pharmacotherapy,2020,21(15):1851-1865.[3]HEUSCH G.Myocardial ischaemia-reperfusion injury andcardioprotection in 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[13]SKLEPKIEWICZ P,SHIOMI T,KAUR R,et al.Loss of secretedfrizzled-related protein-1leads to deterioration of cardiacfunction in mice and plays a role in human cardiomyopathy[J].Circulation Heart Failure,2015,8(2):362-372.[14]PAN S,ZHAO X J,WANG X,et al.Sfrp1attenuates TAC-inducedcardiac dysfunction by inhibiting Wnt signaling pathway-mediated myocardial apoptosis in mice[J].Lipids in Health andDisease,2018,17(1):202.[15]金鑫,郭炳彦,李拥军.AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大过程中分泌型卷曲相关蛋白5表达上调[J].基础医学与临床,2018,38(1):20-25.[16]RUNWAL G,STAMATAKOU E,SIDDIQI F H,et al.LC3-positivestructures are prominent in autophagy-deficient cells[J].Scientific Reports,2019,9(1):10147.[17]LI Z K,ZHU S X,LIU Q,et al.Polystyrene microplastics causecardiac fibrosis by activating Wnt/β-catenin signaling pathwayand promoting cardiomyocyte apoptosis in rats[J].Environmental Pollution,2020,265(Pt A):115025.[18]LORZADEH S,KOHAN L,GHAVAMI S,et al.Autophagy and theWnt signaling pathway:a focus on Wnt/β-catenin signaling[J].Biochimica et Biophysica Acta Molecular Cell Research,2021,1868(3):118926.[19]TAO J,WEI X,HUANG Y,et al.Sfrp1protects against acutemyocardial ischemia(AMI)injury in aged mice by inhibiting theWnt/β-catenin signaling pathway[J].Journal of CardiothoracicSurgery,2021,16(1):12.[20]YANG Y Y,ZHAO L,LI N,et al.Estrogen exerts neuroprotectiveeffects in vascular dementia rats by suppressing autophagy andactivating the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Neurochemical Research,2020,45(9):2100-2112.(收稿日期:2022-06-22)(本文编辑薛妮)。
墨鎏堕登奎兰苎主堕塞兰兰垡鲨苎Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｓｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｅｒｍｉｔｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｏｂｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｖｅｃｔｏｒ，ａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ－ｂｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｎｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｔｗｏｏｒｍｏｒｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡ．ＴｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｏｎｅＩＲＥＳ，ａｎｄｇｅｎｅｉｓｃａｐ·ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ａｎｄｏｔｈｅｒｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅａｖｏｉｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩＲＥＳｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｓｍａｌｌｅｒｇｅｎｏｍｅ，ｈｉｇｈｅｒｖｉｒａｌｔｉｌｅｒａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｕｄｙ，ｔｗｏＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ—ｐｂＧＨｌｍｄｒａｎｄｐｈＧＭ－ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩｎｔｈｉｓＣＳＦＩｔｋｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｍｄｒｌｇｅｎｅｏｒｔｈｅＨＳＶ－ｔｋｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｓ．ＴｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｂＧＨａｎｄｈＧＭ－ＣＳＥＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｉｎｖＮｏｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＰａｒｔｈＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｌａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳＯｂｊｅｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｔｏＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｄｒｕｇ．ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｍｄｒｌｇｅｎｅｗｉｔｈｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ（ｂＧＨ）ｇｅｎｅｉｎｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅＮＩＨ３Ｔ３ａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏ７基因转移到哺乳动物细胞的实验研究，为人类基因治疗提供了先导技术，通过将有意义的外源性基因转移并整合到体内特异细胞的染色体内，用于治疗某些严重感染疾病、遗传病及体细胞基因病（如癌症、家族性心脏病和爱滋病等）的基因治疗将成为２１世纪治疗学的最新手段‘。
GSTO1抑制TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化*张彤， 谢赛阳， 邓伟， 唐其柱△（武汉大学人民医院心血管内科，代谢与相关慢病湖北重点实验室，湖北 武汉 430060）［摘要］ 目的：研究谷胱甘肽S -转移酶ω1（GSTO1）在转化生长因子β（TGFβ）诱导心脏成纤维细胞增殖与活化中的作用。
方法：分离乳大鼠心脏成纤维细胞并进行体外培养。
采用含绿色荧光蛋白（GFP ）的重组腺病毒质粒构建对照（Ad -GFP ）或GSTO1过表达（Ad -GSTO1）质粒并转染心脏成纤维细胞，再用大鼠TGFβ（rTGFβ）刺激细胞24 h ，实验分为4组：Ad -GFP+PBS 、Ad -GFP+rTGFβ、Ad -GSTO1+PBS 和Ad -GSTO1+rTGFβ。
运用qPCR 和免疫荧光染色确定转染的有效性；Western blot 检测GSTO1蛋白表达；划痕实验和EdU 掺入实验评估细胞迁移和增殖；CCK -8实验评估细胞活力；Western blot 和细胞免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）、I 型胶原（Col I ）和纤连蛋白（FN ）的表达水平，并检测心脏成纤维细胞内P38 MAPK 和Smad3信号通路相关蛋白水平。
结果：与Ad -GFP+rTGFβ组相比，GSTO1过表达抑制TGFβ诱导的心脏成纤维细胞增殖（P <0.05），降低TGFβ刺激后α-SMA 、Col I 和FN 的表达水平（P <0.05），抑制P38 MAPK/Smad3信号通路激活（P <0.05）。
结论：GSTO1过表达通过抑制P38 MAPK/Smad3信号通路而阻遏TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化。
［关键词］ 心肌纤维化；谷胱甘肽S -转移酶ω1；心脏成纤维细胞；转化生长因子β；细胞增殖［中图分类号］ R542.2+3； R363.2 ［文献标志码］ Adoi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.04.010GSTO1 inhibits proliferation and activation of rat cardiac fibroblasts in⁃duced by TGFβZHANG Tong ， XIE Saiyang ， DENG Wei ， TANG Qizhu △（Department of Cardiology ， Renmin Hospital of Wuhan University ， Hubei Key Laboratory of Metabolic and Chronic Dis⁃ease ， Wuhan 430060， China. E -mail ： qztang@ ）［ABSTRACT ］ AIM ： To investigate the role of glutathione S -transferase omega 1 （GSTO1） in the proliferationand activation of cardiac fibroblasts induced by transforming growth factor β （TGFβ）. METHODS ： Cardiac fibroblasts from suckling rats were isolated and cultured in vitro . Adenovirus plasmid containing green fluorescent protein （GFP ） wasused to construct control （Ad -GFP ） or GSTO1 overexpression （Ad -GSTO1） plasmid ， and the cardiac fibroblasts transfected with adenovirus were stimulated by rat TGFβ （rTGFβ） for 24 h. Therefore ， the cells were divided into 4 groups ： Ad -GFP+PBS ， Ad -GFP+rTGFβ， Ad -GSTO1+PBS and Ad -GSTO1+rTGFβ. qPCR and immunofluorescence staining were used todetermine the effectiveness of transfection. The expression of GSTO1 protein was detected by Western blot. The migration and proliferation of cardiac fibroblasts were evaluated by wound healing test and EdU incorporation test. At the same time ，α-smooth muscle actin （α-SMA ） was detected by Western blot and immunofluorescence staining. The expression levels of collagen type I （Col I ）， fibronectin （FN ）， and P38 MAPK/Smad3 signaling pathway -related proteins in the cells were also detected. RESULTS ： Compared with Ad -GFP+rTGFβ group ， overexpression of GSTO1 attenuated the proliferation ofcardiac fibroblasts induced by TGFβ （P <0.05）， decreased the expression of α-SMA ， Col I and FN after TGFβ stimula‑tion （P <0.05）， and inhibited the activation of P38 MAPK/Smad3 signaling pathway （P <0.05）. CONCLUSION ： Over‑expression of GSTO1 attenuates TGFβ-induced proliferation and activation of rat cardiac fibroblasts by inhibiting P38MAPK/Smad3 signaling pathway.［KEY WORDS ］ myocardial fibrosis ； glutathione S -transferase omega 1； cardiac fibroblasts ； transforming growthfactor β； cell proliferation［文章编号］ 1000-4718（2023）04-0656-07［收稿日期］ 2022-11-03 ［修回日期］ 2023-02-21* ［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（No. 82170245； No. U22A20269）△通讯作者 Tel ：135****2218； E -mail ： qztang@··656心肌纤维化是响应于心肌损伤的反应性重构过程。
