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气质联用法测定牛奶中氯霉素残留量
陈基耘
【期刊名称】《中国测试》
【年(卷),期】2010(036)006
【摘要】应用气质联用法测定了牛奶中氯霉素的残留量.样品经溶剂萃取后过柱净化、衍生,所得的衍生产物采用气质联用法测定,选择氯霉素衍生物225特征离子进行定量.结果表明,氯霉素浓度在5～50μg·L-1之间进行测定时与其衍生物峰面积呈线性关系,相关系数r=0.9962,且该法的检出限为0.55μ·L-1.牛奶样品中加入氯霉素标准溶液进行回收率测定,测得回收率结果在85%～100%之间.
【总页数】3页(P42-44)
【作者】陈基耘
【作者单位】珠海市质量计量监督检测所,广东,珠海,519002
【正文语种】中文
【中图分类】TQ465.3;TS252.5
【相关文献】
1.液质联用法测定牛奶中氯霉素残留量的不确定度评定 [J], 唐吉旺;袁列江;林源;肖泳
2.高效液相色谱-荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量 [J], 潘莹宇;许茜;康学军;张建新
3.高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留量 [J], 彭莉;岳秀英
4.气相色谱-质谱法测定牛奶中氯霉素残留量 [J], 杨红;迂君;张宏
5.高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留量的研究 [J],
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乳及乳粉中氯霉素残留量的测定方法超高效液相色谱-串联质谱法标准操作程序1 安全提示本试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，操作时须小心谨慎！如溅到皮肤上应立即用水冲洗，严重者应立即治疗。
2 方法提要本标准操作程序是本实验室参照GB/T 18932.19-2003和《残留检测质量控制指南》的有关要求制定。
本方法适用于乳及乳粉中氯霉素残留量的测定和确证。
3 实验部分3.1 原理试样中氯霉素残留用乙酸乙酯提取后，用正己烷脱脂、HLB固相萃取柱净化后，用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测，外标法定量。
3.2 检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度表1 方法的检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度化合物名称检测限（μg/kg）测定低限（μg/kg）线性范围（μg/L）回收率（%）RSD（%）氯霉素0.1 0.2 3.3 仪器和设备3.3.1 液相色谱-质谱联用仪。
3.3.2分析天平：感量0.1mg、0.01g。
3.3.3机械振荡器。
3.3.4 离心机。
3.3.5 涡旋混匀器。
3.3.6 固相萃取仪。
3.3.7 氮吹浓缩仪。
3.3.8 移液枪：50 ~1000μL。
3.4 试剂与材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为高纯水。
3.4.1 试剂3.4.1.1 乙腈。
3.4.1.2 乙酸乙酯。
3.4.1.3 甲醇。
3.4.1.4 氯化钠。
3.4.2 溶液3.4.2.1 氯化钠溶液（4%）：取20 g氯化钠，用适量水溶解后，用水定容至500 mL。
3.4.2.2 乙腈-水溶液（1 + 4）：取20mL乙腈与80 mL水混合均匀。
3.4.2.3 乙腈-水溶液（1 + 7）：取20mL乙腈与140 mL水混合均匀3.4.3 标准物质与标准溶液3.4.3.1 标准物质表2 标准物质列表标准物质英文名称纯度氯霉素Chloramphenicol ≥99.0%3.4.3.2氯霉素标准溶液：储备液100 μg/m L，用甲醇溶解定容，储存在4±4℃。
河南畜牧兽医２００７年（第２８卷）第２期综合版专论综述专论综述高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留的研究综述李红１，张莹蕾２，李永军１，马伟华１（１．河南省乳品工程技术研究中心，河南郑州４５０００８；２．河南三鹿花花牛乳业有限公司）中图分类号：Ｓ８５９．８４文献标识码：Ｂ文章编号：１００４－５０９０（２００７）０３－００１１－０１氯霉素抗菌谱较广，能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，由于其价格低廉、抗菌性能好，是预防和治疗牛乳房炎等疾病的主要药物，但其残留对人体健康的危害不容忽视，它能够导致严重的再生障碍性贫血，并且其发生与使用剂量和频率无关。
因此，近年来美国和欧盟对动物食品中的氯霉素残留量都制定了严格的限制指标，残留量不得超过０．１μｇ／ｋｇ。
我国农业部已禁止使用该药，无论内销还是出口的畜产品，氯霉素残留都是必检项目。
到现在为止，氯霉素残留的检测已相继建立了气相色谱、液相色谱、薄层色谱、放射性分析、微生物法及免疫学检测等方法。
高效液相色谱法是一种快速有效的分离分析技术，它引入了气相色谱理论，在技术上采用高压泵、高效固定和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。
高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留都要经过提取、层析柱净化、浓缩以及残留药物分离和检测。
该文就从这四个方面对高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素的残留进行概述。
１样品的提取与净化１．１样品的提取牛奶中含有大量蛋白质、脂肪、糖类、维生素、无机盐、水分等，这些样品基质的存在不但干扰待测物的检测，而且污染仪器和降低设备使用寿命，因此需要选择合理有效的提取方法。
为了从牛奶样品中提取氯霉素，首先要使蛋白质变性，破坏其胶体状态。
从牛奶中提取氯霉素使用最多的是乙酸乙酯和乙腈，乙酸乙酯既能有效提取氯霉素，又能减少牛奶中蛋白质等水溶性杂质被萃取到溶剂中。
乙腈能够有效除去牛奶中的蛋白质，但萃取效率没有乙酸乙酯高。
使用高氯酸溶液能有效地净化残留物，减少对氯霉素的干扰。
食品工业防褐变、保脆和消毒等多种功能于一体,只需一个单元操作———护色保脆,即可同时达到上述目的。
该护色保脆剂的配方为:亚硫酸钠0120%或焦亚硫酸钠0110%、柠檬酸012%、氯化钙011%、氯化钠014%。
防腐保鲜剂:该剂有两种配方,具有防腐保鲜和防褐变等功能。
一种供带汤汁产品使用,即汤汁配料,其配方为:柠檬酸012%、氯化钠014%、双乙酸钠016%或双乙酸钠012%+山梨酸钾012%、另一种供不带汤汁产品使用,其配方为:柠檬酸012%、氯化钠014%、双乙酸钠115%或山梨酸钾015%+双乙酸钠110%。
虽然在单因子试验中,抗坏血酸钠具有很好的防褐变效果,EDT A对褐变也有一定的抑制作用,但在复合试剂试验中却发现,加有抗坏血酸钠的样品较未加抗坏血酸钠的样品易于褐变,加有EDT A的样品细菌总数远高于未加EDT A的样品,使用焦磷酸钠和不使用焦磷酸钠的试样无明显差别。
故在复合试剂中不使用这三种试剂。
4结论4.1产品感官品质色泽洁白自然,基本保持了原藕的天然色泽,无漂白色;藕片厚薄均匀一致,为2～5mm;汤汁澄清透明,无肉眼可见外来杂质。
具有良好的清脆度;具有原藕的自然风味,无酸涩味及其他异味。
在0～5℃贮藏6个月后,产品仍色白无褐变、带汤汁产品汤汁澄清透明。
4.2卫生品质产品在0～5℃贮藏6个月后:细菌总数:带汤汁产品155个/g,不带汤汁产品167个/g;SO2残留(微量滴定法):带汤汁产品:22～26m g/ k g,不带汤汁产品:28～30m g/k g。
山梨酸残留(高效液相色谱):带汤汁产品:88～102m g/k g,不带汤汁产品:306～309m g/k g。
主要参考文献[1]潘思轶等.莲藕爽汁饮料护色方法及品味调配试验研究.食品科学,1995,(5):30～36.[2]张有林等.莲藕贮期褐变机理与防褐变技术研究.食品工业技术,2003,(1):87～89.[3]胡晓丹等.莲藕酶促褐变的研究.江苏食品与发酵, 1999,(2):1～4.[4]郁志芳等.鲜切莲藕酶促褐变底物的分析确定.食品科学,2002,(4):41～44.[5]陈移平等.水煮莲藕漂白护色工艺研究.食品工业科技,2003,(11):48～49.[6]严守雷等.水煮莲藕片研制工艺学探讨.保鲜与加工,2002,(3):12～14.食品检测摘要建立了对牛奶中氯霉素残留量进行检测的高效液相色谱-荧光测定方法的研究。
食品安全评价：液质联用检测和确认牛奶中的氯霉素Rebecca S. Nicolich a,∗, Eduardo Werneck-Barroso b, Marlice A. S´ıpoliMarques aa Dep◦Qu′ımica Anal′ıtica-IQ/UFRJ, C. Tecnologia, BL A, Ilha do Fund˜ao, 里约热内卢, RJ CEP 219749-970, 巴西b FIOCRUZ-SEF AR/IPEC, Av. 巴西, 4365, Manguinhos, 巴西里约热内卢RJ CEP 21040-900收稿2005年10月18日；修订2006年1月9日；定稿 2006 年 1 月 31 日：在线使用2006年3月9日摘要简单和快速的方法，在牛奶中提取氯霉素(CAP)和液相色谱分析中提取过程耦合四极串联质谱进行分析。
该方法包括使用醋酸乙酯液-液提取，一步酸化的水(10 mmol L−1 甲酸) 和高效液相色谱-质谱/质谱检测。
氯霉素被用作内部标准。
验证方法根据欧盟委员会2002年/657/EC。
校准曲线是线性的典型的r2 值高于0.98。
牛奶中氯霉素绝对回收率证明是95%以上，然而氯霉素-D5d的回收率75%。
该方法是准确和可重现正在成功应用于检测从巴西市场获得的牛奶样品中的氯霉素。
定量限(CCα) 是0.05ng mL−1 和检测限(CCβ) 是0.09ng mL−1。
© 2006埃尔塞维尔科学出版社B.V.保留所有的权利。
关键词: 氯霉素；抗生素；食物控制；高性能液相色谱串联质谱法（高效液相色谱法-质谱/质谱)1.介绍氯霉素(CAP图1）是一种广谱抗生素，它能够对人类造成致命的血液疾病。
因此，当没有其他替代品可用的时候，才会被应用作为治疗严重感染。
然而，在动物中的应用是很有吸引力的，因为动物有良好的耐受性，而且氯霉素在组织和体液中有良好的分布，氯霉素的其他属性对于生产者也很有兴趣。
食品安全评价：液质联用检测和确认牛奶中的氯霉素Rebecca S. Nicolich a,∗, Eduardo Werneck-Barroso b, Marlice A. S´ıpoliMarques aa Dep◦Qu′ımica Anal′ıtica-IQ/UFRJ, C. Tecnologia, BL A, Ilha do Fund˜ao, 里约热内卢, RJ CEP 219749-970, 巴西b FIOCRUZ-SEF AR/IPEC, Av. 巴西, 4365, Manguinhos, 巴西里约热内卢RJ CEP 21040-900收稿2005年10月18日；修订2006年1月9日；定稿 2006 年 1 月 31 日：在线使用2006年3月9日摘要简单和快速的方法，在牛奶中提取氯霉素(CAP)和液相色谱分析中提取过程耦合四极串联质谱进行分析。
该方法包括使用醋酸乙酯液-液提取，一步酸化的水(10 mmol L−1 甲酸) 和高效液相色谱-质谱/质谱检测。
氯霉素被用作内部标准。
验证方法根据欧盟委员会2002年/657/EC。
校准曲线是线性的典型的r2 值高于0.98。
牛奶中氯霉素绝对回收率证明是95%以上，然而氯霉素-D5d的回收率75%。
该方法是准确和可重现正在成功应用于检测从巴西市场获得的牛奶样品中的氯霉素。
定量限(CCα) 是0.05ng mL−1 和检测限(CCβ) 是0.09ng mL−1。
© 2006埃尔塞维尔科学出版社B.V.保留所有的权利。
关键词: 氯霉素；抗生素；食物控制；高性能液相色谱串联质谱法（高效液相色谱法-质谱/质谱)1.介绍氯霉素(CAP图1）是一种广谱抗生素，它能够对人类造成致命的血液疾病。
因此，当没有其他替代品可用的时候，才会被应用作为治疗严重感染。
然而，在动物中的应用是很有吸引力的，因为动物有良好的耐受性，而且氯霉素在组织和体液中有良好的分布，氯霉素的其他属性对于生产者也很有兴趣。
对于渔业来说，这种药物是完美的，由于其长它的半衰期长，在解决方案中；其他抗生素四环素类抗生素，比氯霉素而言不够稳定、应用中需要更大剂量和更频繁的给药。
[1]在巴西，只是最近才禁止将氯霉素用于生产、进口和商业化生产食品的动物[2]。
因此，必须使用其他药物治疗这些动物的感染。
在乳牛产奶的特殊个案中，饲料消费和牛奶生产过程中会导致某些疾病的产生，其中乳腺炎最令人担忧的[3]。
氯霉素在食品生产中的动物中禁止使用是因为它在食物中有残留物或代谢残留物，不可能建立安全摄取量。
联合粮农组织/ 世卫组织食品添加剂专家委员会，考虑到这种物质致命剂量-独立影响的存在，不能确定氯霉素可接受每日摄入量(ADI)，和最大残留限量(MRL)。
因此，在JECFA 的建议下，不只有巴西，而且美国和欧洲联盟也建立了零容忍食品中的氯霉素残留物。
当考虑食物中抗生素残留的影响时，耐药性细菌传播的可能性也非常重要。
一般情况下，这些药物会对耐药细菌的繁殖提供一个有利的选择性压力。
在兽药中，这类试剂的使用也可能产生这种影响。
[4]结果，在商业化可用的食物中发现这种耐药的细菌表型。
[5-7]尽管在处理食物是可以再它们的菌群中监测到，可是确定这些细菌源还是很困难。
[8] 分析兽药在食品中的残留，至少有需要使用的方法：一个用于筛选和另一个用于确认。
必须优化筛选方法，以避免假阴性结果，允许高的采样量和维持低成本。
另一方面，必须优化确认方法为了避免假阳性结果（即，它必须具有高特异性），提供结构说明和数据化的分析[9]。
图.1.氯霉素（A）和氯霉素-D5（B）结构有可能在文献中找到几个中分析不同食品中的抗生素的色谱方法[10-14,] 的模型。
也有很多分析牛奶中氯霉素[15-19，26，27] 的文章。
然而，官方的分析数据要求遵守定量的方法的使用和当地卫生机构设立的定量标准。
在巴西，普遍采取这种欧洲方法做此类型的分析。
在欧洲共同体，分析方法的性能标准是规定由委员会制定2002 / 657 /欧共体[ 20 ]。
在违禁物质的个案中（第四部分，通过理事会条例90 / 2377 / [ 21 ]，其中包括氯霉素），另一个要求是遵守的最低检出浓度（MRPL）。
如今，氯霉素在牛奶中的MRPL是0.3ug kg−1 [ 22 ]。
这项研究的主要目的是要建立和推广在牛奶中检测氯霉素的快速创新方法，以液-液萃取和四极矩液质HPLCMS /MS 检测为基础。
这个方法根据委员会决议2002/657/EC进行验证的，应用牛奶分析样本，由巴西卫生监察程序收集的。
2.实验使用下列试剂：乙腈、甲醇、乙酸乙酯和甲酸。
所有试剂都是高效液相色谱级，生产厂家(费尔菲尔德，美国)。
纯化水由反渗透技术生产(Milli-Q, Millipore)。
2.1.标准溶液制备。
标准品由以下供应商提供：氯霉素来自美国药典标准(USP、罗克维尔、MD、美国），从氯霉素D5 (CAP- D5)来自剑桥同位素实验室（美国马萨诸塞州安多弗CIL）。
氯霉素D5 被用作内部标准(IS)使用。
氯霉素以甲醇/水中(50:50，v: v) 为溶剂配成1mgmL−1 的浓度。
这些溶液被进一步稀释成适当的浓度作为校正的标准。
IS工作溶液用甲醇/水(50:50、v: v)配制成在48 ngmL−1的浓度。
密封，-20 ◦C保存，避光，时间不得超过3 个月。
2.2.仪器条件高效液相色谱-质谱/质谱系统由瓦里安1200L,ESI 能源MS/MS检测器，瓦里安ProStar 430 MS/MS 自动进样器和瓦里安ProStar 210 溶液输送系统(瓦里安，Walnut Creek,美国加州)。
该探测器是通过调整polypropileneglycol溶液注入速度在20mlmin−1，使用注射泵，和优化的解决方案，氯霉素标准溶液0.1 mg ml−1（甲醇/水50 : 50，V：V），含有（10mmolL-1甲酸），使用相同的程序。
使用瓦里安工作柱（100um×20um×5um）结合瓦里安metaguard前处理柱获得色谱分离。
流动相组成0.1%甲酸水（流动相A）和0.1%甲酸在酸性乙腈（流动相B）进行梯度洗脱（0–3分钟，5%B；3.5-6分钟，70%B；6.5–15分钟，5%B），流速0.3mlmin−1。
自动进样器和柱子温度为23±2◦C。
质谱仪是使用于正离子质谱/质谱模式（喷雾）。
氯霉素和氯霉素D5按下列仪器使用条件及cap-d5：针，3600V，隔膜，600V；毛细管，76v；雾化气体，50Psi；干燥气体，30Psi，300℃；载气，氩气，1.80m torr；乘数，2000V；扫描时间，1秒；模拟宽度，0.7amu。
图2.典型添加氯霉素0.3 ngmL−1 （A 和B）在空白牛奶样本图谱和添加氯霉素-D5 1.2ngmL−1 (C)。
仪器在并联反应监视模式下运行，使用以下参数m/ z323→275（定量离子）和m/ z（323 →165（氯霉素确认离子）m/ z 328→280（氯霉素D5定量离子）；与两个MRM动态检测器碰撞能量为−13.5，—23.0和−11.0v，对于氯霉素和氯霉素D5的检测相对丰富，分别上升到50%（图2）。
2.3样品溶液制备2毫升牛奶样品加50ul的IS工作溶液（48 ngml−1）混合10秒，经过10分钟的平衡，加水0.8ml水（添加了10mmolL-1甲酸）和4ml乙酸乙酯。
提取的样品，10分钟旋转混合器（Fanem，255B型，S˜ao Paulo, SP)，400转。
之后，他们被离心5分钟3200转时。
上清液转移到另一个管，沉降物再用乙酸乙酯提取（不过这次不加水）第二次上清液被添加到第一次上清液中，通氮气，40℃蒸干。
残留物溶解在200ul的混合溶液（水/甲醇，50 : 50，V：V，含10 mmolml−1甲酸）和混合20S，提取物注射到LC的体积是50uL。
如果是奶粉样品，按照标签说明来复原。
用吸量管吸取2ml等量的复原奶。
所有样本已被保存在−20 ◦C，避光，直到他们被处理。
2.4方法验证方法验证使用的实验设计是基于ResVal Versie 2.1®提出的CRLBilthoven(RIVM,荷兰), 这是由 Saskia Sterk博士和Henk Herkbold博士提供的信息。
一个相同质量的空白池超高温灭菌奶先用酶联免疫吸附试验放射性同位素稀释测定筛选（R-生物制药，达姆施塔特，德国）分为93个子样本，又分为三组31个样本。
在不同的日子，每一组31个样品，构建2种刻度线，一个用于计算氯霉素的浓度的准确度和精密度试验（其中应称为“标准曲线”）和其他用于估计CCa和CCb（“控制线”）；因此，用三天时间进行了三个实验。
校准线包括六个浓度水平：0.00，0.30，0.45，0.60，1.20和3.00 ngml−1氯霉素在牛奶中。
为“校准曲线”，各级均一式两份。
为“控制曲线”，0.30，0.45和0.60 ngml−1准备在六个复制和水平的0.00，1.20和3.00 ngml−1不准备复制（只有一个样本准备）。
所有样本都有1.20 ngml−1 的氯霉素-D5牛奶。
该比率最高的区域的不同浓度组分，是计算和绘制一级强化。
线性确定线性回归。
没有特别的计算校正过程中损失提取的运用（如恢复因子），因为一个是被用来。
精密度和准确度的方法进行了评价结果间的水平0.30，0.45，0.60，1（ngml−相当于1×信息，1.5×信息和2×信息）。
这评价是通过计算这些上限浓度三个层次的“控制”模式的使用“校准曲线”。
图3.氯霉素碎片该方法的特异性的评价分析10不同的空白样品（包括超高温灭菌和奶粉）中为探讨可能干扰洗脱氯霉素的保留时间。
此外，这些样品进行了强化一次验证水平（0.30 ngml−1）为了调查是否有任何基体效应的量化氯霉素。
这量化一个新的校准曲线准备（六个级别一式两份）绝对恢复组分测定比较峰面积从空白牛奶样品添加已知数量的上限（0.30，0.45和0.60 ngml−1）和前编写程序，以峰面积由基质提取物尖刺后。
六复制进行在每一级。
通过比较确定绝对恢复的程序峰值领域从飙升与已知的空白超高温灭菌奶样本帽 (0.30、 0.45 和0.60 ngmL−1）的金额，是前峰区从矩阵的制备过程中提取它后大幅飙升。
在每个级别进行了六个复制。
2.5实际样品的应用这些方法适用于确认先前用酶联免疫吸附试验筛选的41个牛奶样品的存在（R-生物科技制药，Darmstadt,，德国）。
2004年这些样本与其他一起由当地卫生监督机构从巴西市场获得。
