当前位置：文档之家 › 6 第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定

6 第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定

  • 格式：ppt
  • 大小：8.11 MB
  • 文档页数：77

下载文档原格式

  / 77

合集下载

基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2

基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2

基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2二、重组DNA分子转入真核细胞1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。

迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。

农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。

植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。

具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。

根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。

步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生2. 高压电穿孔法利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。

利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。

具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。

（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。

经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。

应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。

（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：① 外加电场的强度：250～750 V／cm较宜；② 电脉冲的时间：20～100ms；③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；④ DNA的构象和浓度：线性 DNA比环状 DNA要好，浓度控制在1～ 40μg／mL。

⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液更易DNA的导入。

第六章重组体的筛选与鉴定2007

第六章重组体的筛选与鉴定2007

4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
Immuno Blotting
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选 择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选 其产物是否符合预期。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。

重组体筛选和鉴定PPT课件

重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。

演示文档第六章 目的重组子的筛选与鉴定.ppt

演示文档第六章 目的重组子的筛选与鉴定.ppt

ori
yes
yes
8
Replica plating: one plate
to another using absorbent pad or Velvet (绒布).
transfer of colonies
+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
噬菌斑，从而达到初步筛选的作用。
优选文档
14
二、应用限制性内切酶酶切分析筛选
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培 养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用 相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入 片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切 酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片 段和载体的大小。
优选文档
2
不同检测方法可以归类于以下三个层次： 1. 载体遗传标记检测 2. 克隆DNA序列检测 3. 外源基因表达产物检测
优选文档
3
一、根据遗传表型筛选
1．抗生素平板筛选 2．互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选
优选文档
4
1．抗生素平板筛选
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有 抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗 卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载 体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的 插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子 的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长 成菌落。
优选文档
11
蓝白筛优选选文档
12
3．插入表达筛选
有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负 调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的 筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因 上 游 存 在 CI 基 因 的 负 调 控 序 列 ， CI 基 因 可 以 抑 制 Tetr 基 因 的 表 达 ， 当 外 源 DNA 片 段 插 入 CI 基 因 的 HindⅢ或Bgl I位点时，Tetr基因阻碍解除而表达， 阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet - 表型， 故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片 段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。

克隆鉴定

克隆鉴定
第六章第六章重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法pcrpcr法鉴定克隆法鉴定克隆酶切鉴定克隆酶切鉴定克隆核苷酸序列的测定核苷酸序列的测定克隆基因的表达验证克隆基因的表达验证菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法挑克隆挑克隆pcrpcr法鉴定克隆法鉴定克隆100l100l培养物中加入培养物中加入500l500l水水2mllb372mllb37223h3h离心保留沉淀离心保留沉淀重悬于重悬于500l500l水中煮沸水中煮沸pcrpcr测序测序电泳电泳酶切鉴定克隆酶切鉴定克隆挑克隆挑克隆2mllb372mllb37过夜培养过夜培养质粒提取质粒提取酶切质粒酶切质粒电泳电泳测序测序转染转染克隆基因的表达鉴定克隆基因的表达鉴定收集细胞并裂解收集细胞并裂解sdssdspagesdssdspagepagepagewesternblotwesternblotadam8151719cdnapcdna31v5hek293cellsdspagewesternblotv5antibodyhrpproteingsubstract?v5tag?gkpipnpllgldst?hglylysproileproasnproleuleuglyleuaspserthroh?thissequenceisfromthecterminal?thissequenceisfromthecterminalsequenceofthepandvproteinsofsimianvirus5?hrphorseradishperoxidase辣根过氧化物酶教学要求?掌握
• V5 tag • GKPIPNPLLGLDST • H - Gly - Lys - Pro - Ile - Pro - Asn - Pro Leu - Leu - Gly - Leu - Asp - Ser - Thr – OH • This sequence is from the C-terminal sequence of the P and V proteins of Simian Virus 5 • HRP (horse radish peroxidase,辣根过氧化 物酶 )

高中生物 第六章基因重组与基因工程

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作

47
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。

重组基因的导入和鉴定


该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20％，但长期表达效 率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。
(2)DEAE-葡聚糖转染法
二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外 源DNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获DNA的机制还不清楚，可能是因 为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结 合面引发了细胞的内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他DNA，适 合于细胞瞬间表达检测及小量DNA的转染。
一、基因转移的物理方法
物理方法
裸DNA直接注射 微粒轰击 电穿孔 显微注射
(1)裸DNA直接注射
1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使 载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出 注射的外源核酸与宿主染色体整合。
因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮 细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并 激发有效免疫应答。
(2)基因枪介导的皮内或皮下导入
80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术 的局限。
真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的 基因转化方法。
固定细胞技术
显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。 首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。 常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法
ROI ROP

第六章重组体的筛选与鉴定


一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

2）受体细胞
3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率
第三节 重组子的筛选与鉴定
一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法
五、核酸杂交检测法
六、免疫化学检测法
七、DNA序列分析
一、载体表型选择法
1. 抗药性标记及其插入失活选择法
nick缺口
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何片
段连接起来
④缺点： 操作繁琐；
外源片段难以回收；
同聚物尾巴影响外源 基因表达。 非酶切位点
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接
Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数
3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体 的T-DNA区，形成重组 DNA
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 重 组 DNA 转 入 含 有 Vir致病基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点
请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保 护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外 ，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序 列。写出P1和P2的引物序列。
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
第六章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组 合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 DNA 连 接 酶 把 相 互 靠 近 的 5’ 端 磷 酸 与
3’-OH连到一起
单酶切、双酶切
二、平末端（blunt end）的连接
1. 2. 3. 4. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导法 显微注射法 DEAE-葡萄糖转染法
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 原理： 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入 哺乳动物细胞 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10% 的细胞能吸收DNA沉淀。
操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、
3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞
（2）转化率高，105个 / g DNA
（3）单链转化率高于双链
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导）
2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等）
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
三、Gateway 载体构建系统
（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
√
第二节 重组体导入受体细胞
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
三、转化率及影响因素
例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态
细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复
一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌
落，转化率为多少？
转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg
（一）转化（transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
（1）热激法
制备感受态细胞
① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性 感受态细胞：处于能吸 收外源DNA分子的生理 状态的细胞
（1）热激法 制备感受态细胞 ② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理
1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，处于感受态； 2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；
个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
EcoR I linker：
G多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接
（3）限制性内切酶消化
（4）目的片段与载体连接
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （3）DNA接头 （adapter）连接法
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） P-P 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
DNA
吸附
1.2m钨弹头 外植体制备
装入
基因枪 轰击
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细胞
具 体 操 作
1. DNA微弹的制备
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
3. 电击法（电穿孔法） 纤维素酶 植物细胞
和果胶酶
原生质体
DNA
电击处理 选择培养
愈伤组织
混合入 电击缓冲液
分化
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞
（二） 转
导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。 每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接 被感受态细胞捕获的过程。 与转化无本质区别 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
体 外 包 装 过 程
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
三、PCR产物的连接 2. 与T载体直接连接 PCR产物 载体
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染 植物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将含有外源目的基因的TDNA整合到植物细胞基因 组中，获得转基因植株
叶 盘 法 的 具 体 操 作
在饲养平皿的滤 纸上培养2天
2. 基因枪法（gene gun） 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微 粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理
感受态
热激
插入外源基因的载体
40% PEG 4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍
转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
三、转化率及影响因素
例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为 107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载 体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104 个重组克
隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？
104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。 5’ P3’ HO-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
5’ P3’ HO-
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
dNTP
A
Taq DNA聚合酶
dTTP T
A
T
TA
TA
三、Gateway 载体构建系统
噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。
入门克隆
改造过的各种表达载体
三、Gateway 载体构建系统
（1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆
效果稳定，但转染效率低。