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医学Percoll密度梯度离心教程专题课件

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percoll密度梯度离心分离粒细胞

percoll密度梯度离心分离粒细胞

percoll密度梯度离心分离粒细胞Percoll密度梯度离心分离粒细胞是一种常用的细胞分离方法。

它可以有效地根据细胞密度的不同，将想要分离的细胞种类纯化出来，特别适用于混合细胞的分离、浓缩和纯化。

接下来，我们来看看Percoll密度梯度离心分离粒细胞的详细步骤：第一步：准备工作首先需要准备好一些实验室必备的材料和试剂，如Percoll溶液、PBS 等，同时需要根据实验需要选择不同的离心管进行实验。

第二步：制备Percoll密度梯度离心液将Percoll加入离心管中，并利用离心机的速度让Percoll形成梯度。

常见的是形成4-5层梯度，顶端的Percoll密度较低，逐渐递增，底部的密度最大。

第三步：制备细胞悬液将要分离的混合细胞通过离心等方法获取细胞悬液，可进行滴定、显微镜下计数等操作。

第四步：取样分层用移液器或者其他方法轻轻地取样，小心地分层到离心管顶部或者第二层梯度处，避免把悬浮细胞带入离心管中，并且尽量确保每层离心管的样品量相同。

第五步：离心将离心管放在离心机中，离心速度视不同的细胞类型而定。

离心过程中需要慢速启动，逐渐加速，并持续约20分钟，直到形成细胞亮点，注意不要离心过久，以免细胞受损。

第六步：取样将感兴趣的细胞种类悬浮液层取出并转移至新的空离心管中，可进行后续细胞培养、细胞生物学研究或RNA/DNA等实验应用。

通过这个过程，我们可以选择性地纯化出我们所需的细胞种类，从而为后续实验提供有力的支持。

需要注意的是，在进行Percoll密度梯度离心分离细胞时，离心速度和时间要求严格控制，以免对细胞造成损伤。

同时，多次操作后，Percoll梯度分层很可能失效，因此需要每次制备新的Percoll密度梯度离心液。

总之，Percoll密度梯度离心分离粒细胞是一种简单、快速、高效的细胞分离方法，在生物医学研究中具有广泛的应用价值。

密度梯度离心法PPT课件

密度梯度离心法PPT课件
即： 1S= 10-13秒 例：某物质的沉降系数是10-12秒
可写成：10× 10-13秒 表示为：10S
如：核蛋白体为 70S
细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件
名称 沉降系数/S
RCF/g
转速（rpm）
细胞
﹥107
﹤200
﹤1500
细胞核 4×106-7
600~800
3000
线粒体 2×104~ 7×104
三、沉降系数（sedimentation coefficient，S） 1924年Svedberg对沉降系数下的定义：
颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
若ω用2πn/60表示，则
式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离； X2为离心后粒子离旋转轴的距离。
S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13 秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒。
1994 Avanti J全球独有,利用可变磁阻驱动系统的高效离心。 1996 Optima XL-I拥有两种检测系统的分析型超速离心机。 1998 Optima MAX全球首台超过一百万离心力的台式超速
离心。 1998 ARIES全球独有可以自我修正平衡的转头。 2002 Optiam L-XP全球首先采用触幕式操作的超速离心机。 2004 Allegra X-12全球唯一可处理细胞培台式离心机。
1979 L8 Series全球首先采用微机控制及感应电机驱动的 超速离心机系列。
1982 J21-M全球首台采用感应电机驱动的高速离心机。 1984 TL-100全球首台微量台式超速离心机。 1989 Optima Series 首先采用半导体制冷的驱动系统的超
速离心机系列。
1989 NVT创新的近垂直转头,可快速提纯DNA样品。 1991 Optima XL-A重新设计的分析型超速离心机。

Percoll 密度梯度离心教程

Percoll 密度梯度离心教程

ρo = density of Percoll (1.130 + 0.005 g/ml*)
may be removed by low speed centrifugation. If any significant evaporation occurs during autoclaving, the volume should be replenished with sterile water so that the
Percoll density gradient centrifugation
Outline
Principles Physical properties Storage Make and use density of Percoll Tips Protocol Instrument and operation References and applications Contrast(differential velocity centrifugation)
பைடு நூலகம்
DCoenndsiutycti1v.it1y301.±0 m0S.0/0c5mg（/m电TPlhe导ercv率oilsl ）cisosloitwyeorfin
Osmolality < 25 mOsm/kg sHa2liOne（s渗olu透tio压ns）at
Viscosity 10 ± 5 cP at 20°phCy（sio粘log度ica）l ionic
Principles of density gradient centrifugation

Separation by density (isopycnic centrifugation)

percoll密度梯度离心分离星形胶质细胞

percoll密度梯度离心分离星形胶质细胞

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密度梯度离心课件

密度梯度离心课件
样品装载
将准备好的样品装入离心管中 ，注意样品装填均匀，避免出
现空洞或偏心。
平衡液加盖
将平衡液加盖到离心管中，注 意液面高度与样品一致，以保 证离心效果和实验结果的准确 性。
离心条件设置
根据样品特性和实验目的，设 置合适的离心速度、时间和温 度等条件。
离心操作
启动离心机，按照设定的条件 进行离心操作。
平衡液不稳定
原因
平衡液不稳定可能是由于平衡液的成分不正确或离心过程中的温度变化引起的。如果平衡液的成分不正确，会导 致样品在离心过程中出现沉淀或聚集。而温度变化则会影响平衡液的密度，进而影响样品的分离效果。
解决方案
在选择平衡液时，应确保其成分与样品相似，并且具有稳定的密度。此外，在离心过程中应保持稳定的温度条件 ，以确保平衡液的密度不会发生变化。
原理
密度梯度离心原理基于样品中各组分的质量和离心力场中的浮力之间的关系。在 离心力场中，样品中的各组分会根据其质量和浮力差异进行迁移，质量较大的组 分会向离心管底部迁移，质量较小的组分会向离心管顶部迁移。
密度梯度离心的应用
01
02
03
分离细胞器
密度梯度离心可用于分离 细胞中的各种细胞器，如 线粒体、叶绿体、溶酶体 等。
清洗去除杂质，提高样品纯度和离心 效果。
平衡液配制
选择合适的平衡液
根据样品特性和实验目的 ，选择合适的平衡液，以 保证离心效果和实验结果 的准确性。
平衡液配置
按照平衡液配方和比例， 准确配置所需浓度的平衡 液。
平衡液过滤
过滤去除平衡液中的杂质 和颗粒物，确保离心效果 和实验结果的准确性。
离心操作
在离心过程中不得随意打开离心腔盖 子，以免气流冲击导致安全事故。

密度梯度离心PPT课件

密度梯度离心PPT课件
Centrifugation techniques: (1) Differential centrifugation (差速离心) (2) Density-gradient centrifugation (密度梯度离心)
-
4
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
5、沿离心管壁小心缓慢地加入0.6 mL叶绿体匀浆。
6、离心：8000r/min，20min；叶绿体在密度梯度液中间形成带。
7、取叶绿体悬液1滴（10～15uL）滴于载玻片上，加盖玻片后观察。
观察一：在普通显微镜下观察叶绿体形态（油镜）；
观察二：在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光（蓝光）。
8、取一滴悬液在载玻片上，加1滴0.1%吖啶橙荧光染料，加盖玻片。
材料新鲜菠菜10三实验流程min4层纱布过滤于烧杯中8000rmin20min制片菠菜叶洗净去叶梗和主脉匀浆介质50蔗糖溶液04ml15蔗糖溶液04ml06ml10ul111新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干后去除叶梗及粗脉称30g于100ml匀浆介质中放入组织捣碎机
实验四 叶绿体的分离与观察
实验五 植物细胞液泡系与 细胞骨架的染色与观察
0.4mL
Байду номын сангаас
0.4mL
匀浆介质
制片 镜检
10 uL
-
8000r/min 20min
10
实验步骤
1、新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于100mL 匀浆介质中，放入组织捣碎机。

ercoll密度梯度离心教程

ercoll密度梯度离心教程

ρi= density of SIP solution produced (g/ml)
Thus, for SIP in saline, ρi = 1.123 g/ml,
“渗透活性物质的物质的量除以溶液的体积称为溶液的渗透 浓度（osmolarity），单位为mol/L或mmol/L”
for SIP in sucrose, ρi = 1.149 g/ml, assuming ρo = 1.130 g/ml.
• pH 9.0 ± 0.5 at 20°C
physiological ionic
• Refractive Index 1.3540 ± 0.005 at 20°C（折射率）
• Percoll is non-toxic
Storage of Percoll
• Sterile and unopen----5 years • When opened, Percoll should be stored below +8℃ • If Percoll opened under non-sterile conditions, it can be frozen
• For biological particles, the ideal gradient medium has been described as one having the following characteristics:
• covers a sufficient density range for isopycnic banding of all biological particles of interest • possesses physiological ionic strength and pH • is iso-osmotic throughout the gradient • has low viscosity • is non-toxic • will not penetrate biological membranes • is supplied sterile and is resterilizable • will form self-generated gradients by centrifugation at moderate g-forces • is compatible with biological materials • is easily removed from purified materials • does not affect assay procedures • will not quench radioactive assays

Percoll非连续性密度梯度离心法

Percoll非连续性密度梯度离心法

基本原理：本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。

此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。

试剂与器材·外周血单个核细胞·PBS 1×和PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA·胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）·HCl 1mol/l·Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）·4g/L台盼蓝染液（溶解在PBS液中）·50ml聚丙烯圆锥管·毛细吸管·移液管（1、2、10ml）·CO2孵箱·超净台·有旋转桶转子装置的离心机·PH计易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂库：/yp/product-list-43.html操作步骤：所有的操作应该在无菌条件下进行（一）不同密度Percoll分层液的配制1.Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+ Mg2+）3. Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2. 32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）（二）不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1. 080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。

离心技术专题讲座PPT

离心技术专题讲座PPT
泵、喷嘴、螺旋等 使用温度：冷冻和常温
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三.离心分离方法
根据离心原理,按照实际工作的需要，目前 已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分 三类
差速离心法 平衡离心法
速率区带离心法
离心分离法 等密度离心法
沉降平衡离心法
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பைடு நூலகம்
1.平衡离心法
根据粒子大小、形状不同进行分离。
差速离心法(differential velocity centrifugation) 速率区带离心法(rate zonal centrifugation)。
缺点：
区带转头的样品及介质与转头直接接触，要求转子耐腐蚀， 并且操作复杂。
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5、连续转头：
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自动排出沉渣的离心澄清机
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分批自动排出沉渣的离心澄清机
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（三）根据用途分类： 实验室或工厂、分析或制备
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（四）根据离心形式分类：
离心过滤：指在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮
液的过程。
2.注意点：
离心时间要长 可用角式转头或水平式转头 粒子密度相近或相等时不宜用 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用刹车
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收集区带的方法：
用注射器和滴管由离心管上部吸出;
有针刺穿离心管底部滴出;
用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带 抽出;
用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最 大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自 动部分收集器收集.
的变化,从开始的水平方向改成垂直方向,当 转子降速时,垂直分布的液层又逐渐趋向水平, 待旋转停止后,液面又完全恢复成水平方向。
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4、区带转头：
特点：

密度梯度离心法取单个核细胞具体方法ppt课件

密度梯度离心法取单个核细胞具体方法ppt课件

五、RPMI-1640培养液
RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋
三蒸水
1000毫升
电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～
7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验， 4℃保存。
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实验所需试剂的配置方法
六、不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640
0.1M丙酮酸钠
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可编辑课件
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
0.2M谷氨酰胺 1M Hepes 7.5％ NaHCO３ 青霉素、链霉素(各1万单位)
95毫
1毫
1毫升 1毫升 1毫升 1毫升
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实验所需试剂的配置方法
七、完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液 灭活胎牛(或新生牛)血清
90毫升 10毫升
可编辑课件
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实验补充知识
• 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液， 其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖 （商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密 度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶 液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低 浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛 影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分 层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即 可配制成密度合适分层液。

percoll分离法

percoll分离法

percoll分离法
Percoll分离法是一种常用的离心梯度离心分离技术，用于分离和富集不同密度的细胞、细胞器或其他生物大分子。

Percoll（聚乙二醇聚丙烯醛）是一种用于制备梯度离心介质的人工胶体。

它由聚乙二醇基质形成，其中包含聚丙烯醛颗粒。

这种颗粒会形成密度梯度，使得在离心过程中，样品中的组分可以根据密度的差异而分离。

Percoll分离法的主要步骤如下：
1.探索性实验：根据要分离的样品和目标细胞或组分的理想
密度范围，首先进行一系列的探索性实验，确定最佳的离
心梯度和离心速度。

2.制备离心梯度：根据实验结果，配置合适密度梯度的
Percoll溶液，并将其分层置于离心管或离心管套装中。

通
常采用高浓度至低浓度的梯度，使得样品在离心过程中可
以在不同密度的Percoll层之间分离。

3.样品准备：将待分离的样品处理并加载到离心管中。

根据
需要，可能需要对样品进行细胞破碎、去除细胞碎片或其
他预处理步骤。

4.离心分离：将装有样品和离心梯度的离心管放入离心机中，
进行离心分离。

离心过程中，不同密度的细胞或组分将在
Percoll梯度中上下移动，最终分布在不同层次上。

5.分离后处理：离心分离完成后，可以通过采样、甩掉上层
的液体等方式，收集、富集分离后的目标细胞或组分。

Percoll分离法在生物学和生物医学研究中广泛应用，特别适用于细胞分离、亚细胞器富集和病毒精制等领域。

它具有高分辨力、操作简便、分离效果好等优点，有助于获得纯度较高的目标样品。

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Percoll密 度梯度离 心教程
Outline
• Principles • Physical properties • Storage • Make and use density of Percoll • Tips • Protocol • Instrument and operation • References and applications • Contrast(differential velocity centrifugation)
• Percoll is available from GE Healthcare. • Composition silica sol with nondialyzable polyvinylpyrrolidone
(PVP) coating（由聚乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒） • Density 1.130 ± 0.005 g/ml 1.0~1.3g/ml • Conductivity 1.0 mS/cm（电导率） The viscosity of Percoll is • Osmolality < 25 mOsm/kg H2O（渗透压l）ower in saline solutions at • Viscosity 10 ± 5 cP at 20°C（粘度） physiological ionic • pH 9.0 ± 0.5 at 20°C • Refractive Index 1.3540 ± 0.005 at 20°C（折射率） • Percoll is non-toxic
speed centrifugation. • If any significant evaporation occurs during autoclaving, the
volume should be replenished with sterile water so that the density is not affected.
•For biological particles, the ideal gradient medium has been described as one having the following characteristics:
• covers a sufficient density range for isopycnic banding of all biological particles of interest • possesses physiological ionic strength and pH • is iso-osmotic throughout the gradient • has low viscosity • is non-toxic • will not penetrate biological membranes • is supplied sterile and is resterilizable • will form self-generated gradients by centrifugation at moderate g-forces • is compatible with biological materials • is easily removed from purified materials • does not affect assay procedures • will not quench radioactive assays
Sterilization of Percoll solutions
• 120°C for 30 min • Absence of salts or sucrose. • Minimum contact with air (narrow-necked bottle) • If Percoll form particles, these particles may be removed by low
How to make and use gradients of Percoll
—Making and dilutl
Adding 9 parts (v/v) of Percoll to 1 part (v/v) of 1.5 M NaCl or 10× concentrated cell culture medium is a simple way of preparing a Stock Isotonic Percoll (SIP) solution.
for up to 6minths at -18℃ • Preformed gradients can be stored for weeks without a change
in gradient shape, provided that the gradient is sterile and is not physically disturbed • If stored at -18°C, gradients form upon thawing, necessitating a mixing of the contents of the bottle before use.
Storage of Percoll
• Sterile and unopen----5 years • When opened, Percoll should be stored below +8℃ • If Percoll opened under non-sterile conditions, it can be frozen
Principles of density gradient centrifugation
•
Separation by density (isopycnic centrifugation)
Separation by size (rate zonal centrifugation)
Percoll – physical properties