流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪细胞周期测定步骤
1）将细胞以1×106接种于60mm培养板，80％汇合后转染。

2）24小时后在新鲜培养液中加入适当的抗生素（真核表达载体上的抗性标记）进行培养（该步可选）。

3）48－72小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入1ml 70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。

4）PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。

5）0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和 RNaseA至终浓度50µg/ml，37℃ 温浴30 min。

6）用流式细胞仪测定周期。

PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4℃保存。

RNaseA：10mg/ml
应用：通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。

流式细胞仪细胞周期测定经验:1.在测定细胞周期的时候（以BD公司的Calibur为例），除了设置好获取数据的模版外，另外设置以FL3为横坐标的直方图，测量模式为对数（log），调整放大倍数，使二倍体峰出现在横坐标10*3的位置，就很容易的找到了二倍体峰和细胞周期个时相细胞的分布情况。

根据它再调节FL2（线性模式下）的放大倍数，使二倍体峰在10*2的位置即可。

流式细胞术检测细胞周期的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!流式细胞术检测细胞周期的技术流程详解流式细胞术是一种强大的生物学分析技术，广泛应用于细胞周期的研究。

细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1期、S期、G2/M期。

在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。

细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。

因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson）公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。

一、PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。

2、PBS 1ml离心，弃上清。

3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。

4、PBS 1ml离心，弃上清。

5、RNase A的PBS溶液(20ug/ml)，500ul，37℃，30min，离心弃上清。

6、PBS 1ml离心，弃上清。

7、PI的PBS溶液(50ug/ml)，500ul，室温避光孵育30min。

8、吹打混匀，300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。

二、Calibur仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件，按快捷键Command+B连机，按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation 面板和Status面板，软件的操作界面如图1所示。

图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。

因为PI 在Calibur上是由488nm的激光器激发，530/30滤光片收集信号，所以选择FL2通道进行检测。

细胞周期是2N和4N的循环，所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param参数设置为FL2-H，Four Color DDM Param参数设置为FL2，如图2、图3所示。

流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。

望专家教教我是哪里出错。

做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。

过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。

3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。

BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。

2、把鞘液桶装上，拧紧。

3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。

（关机时从左向右关）。

4、按流式细胞仪开关。

换上新的已装超纯水的流式管。

5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。

6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。

最后停至小头。

自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。

7、插电脑白色插头，打开电脑。

8、到无气泡时候调到“hign”“run”。

9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。

File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。

10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。

11、上样。

使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。

确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。

仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。

调界面操作：Cytometer → Detectors/Amps出现 Detectors/Amps 界面后，调FSC和SSC和FL2和FL2-W。

FSC调节的是门内(R1)细胞位置的左右，FSC的“Voltage”调到“E-1”，“E-1”是指个体很大细胞；“Amo Gain”的值调节门内(R1)细胞位置的宽度。

流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!1. 引言在生物学研究中，了解细胞周期对于理解细胞生长和分化过程至关重要。

流式细胞技术检测细胞周期分布1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。

1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀；2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。

重复此步骤2次，以除去胰酶；3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜；4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇；5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。

6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。

接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。

实验重复3次。

2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内；3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。

避光室温孵育15min；4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育；空白：Annexin V—FITC结合液200ul双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC190ul结合液+10PI5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。

话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。

简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。

就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。

而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。

如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。

流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。

这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。

咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。

第一步，准备工作。

先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。

接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。

这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。

记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。

不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。

第三步，数据采集。

照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。

这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。

别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。

这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。

比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。

流式细胞仪检测细胞周期
周期分析
操作篇
写在前面
流式细胞术的原理篇我先卖个关子，先来个简单的周期分析操作篇~
通过流式细胞术进行DNA周期分析，可以测定细胞的DNA含量哦~
准备工作☞☞☞制备单细胞悬液于200 μl的PBS缓冲液中；加入2 ml预冷的70%乙醇，4 ℃保存；
步骤
1.肿瘤细胞按300,000-500,000细胞/孔接种于6孔板中；24小时后，加入药物；24-72小时后，EDTA消化并收集细胞，取单细胞悬液1-2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；
2.1500 rpm离心5分钟，弃上清，反复两次；
3.重悬细胞于0.5 ml PBS缓冲液中（第二次在eppendenf管中）；
4.加入1 ml冷75%乙醇，混匀，保存于4 ℃（或-20 ℃），至少30分钟。

在-20 ℃条件下可保存2-3周；
5.1500 rpm离心5分钟，去上清，用500 μl PBS重悬细胞，加入5 μl RNaseA消化，去除RNA影响；
6.加PI染液5μl重悬细胞，室温避光20-30分钟；
7.若有明显的黏附，需再用筛网过滤；
8.上机检测。

488 nm激发波长测定。

注意：
1.根据实验的要求，固定剂也可选用1-3%多聚甲醛；
2.将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0-4 ℃；
3.细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓
度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）；
4.单细胞浓度应为106/ml，以免影响CV值和检测结果。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。

↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C。