流式细胞仪检测技术与质量控制

实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。

各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。

随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。

本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。

实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。

其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。

当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。

根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。

一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。

流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER 公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。

概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。

一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。

待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。

2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。

（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。

（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。

（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。

（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。

（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。

（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。

3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。

二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。

环境检测中微生物检测的质量控制摘要：随着经济和社会的快速发展，越来越多的安全事故发生，人们开始关心食品卫生问题，国家有关部门也加强了对环境行业的监督管理。

环境安全不仅与人民的身体健康密切相关，还将对企业的生产效率和市场竞争力的提高产生直接的影响，甚至有可能危害到国家经济安全和社会稳定。

所以，做好环境监测监管工作是非常必要的。

目前，国家已经开始对生物危险因素和常见病原菌的监控，以及加强环境微生物检测的品质控制。

关键词：环境检测；微生物检测；质量控制引言微生物如细菌，真菌，病毒等会儿粘附到大气颗粒物上，就会产生生物气溶胶。

在公共场合使用中央空调进行通风时，会把一室的病原细菌传染给另一室，引起机体产生过敏性反应等多种疾病。

类似的，在公众场合使用的公用物件也可能会导致病原体的传播。

在公共场所，若没有经过有效的灭菌，将有可能引起传染病的病菌得以生存和繁衍，从而引起传染病的蔓延。

为降低病原菌感染的危险，防止疾病的蔓延，有必要对公众场所进行常规的细菌的检验。

概述了大气中各种细菌的测定技术及其在空气中的应用，以期对提高空气微生物检测方法及应用进行综述，为完善环境安全提供参考。

一、我国开展微生物检验工作中应强化安全管理（一）一个良好的实验室工作环境能够保证员工的身体和精神上的健康，让员工的情绪变得轻松愉快，从而增强员工对自己工作的认同感，从而更好地促进检测工作的开展。

（二）微生物实验室的安全性与检测结果的可靠度密切相关，高安全性的实验室能够降低其他因素对检测的影响。

比如，微生物检验实验室中常用的压力蒸汽消毒锅和生物安全柜等设备，既可以用于生物安全防护，又可以保证实验室检测结果的准确可靠。

（三）建立具有较高安全水平的微生物检验实验室，能够有效地降低检验过程中出现的各种突发事件的概率，从而有效地降低检验过程中的风险与费用。

二、微生物检测技术概况（一）生化反应鉴定检测技术常规的生物化学识别法虽然识别出的生物标志物具有较高的准确度和可靠性，但其识别过程较费时。

流式细胞仪标准操作规程××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号：××-JYK-MY-×××版本：生效日期：共页第页1.目的建立规范标准的××型流式细胞仪操作程序确保流式细胞检测结果准确可靠2.仪器名称及型号××（品牌）××（型号）流式细胞仪。

3.应用范围适用于免疫组经授权的检验技术人员。

4.仪器简介和测试原理流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号，工作在测量区进行。

所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。

液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2x的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。

散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。

未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。

经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。

散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

因此流式细胞仪综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。

5.开展项目包括：常规免疫功能检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、免疫细胞分型、造血干细胞检6.仪器环境要求无尘、通风良好的环境，无直接日照。

温度：18～25℃，温度的改变应该<2℃/h。

室内湿度：30%～80%。

7.操作规程7.1·设备每日开机程序：开启稳压电源、变压器，打开流式细胞仪电源。

开启其他周边配备电源，如打印机，开启计算机。

确认鞘液筒有八分满，废液桶近似空的，桶盖是旋紧的；所有管线及管路装置连接通畅，无扭曲、折叠。

流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。

由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。

同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。

作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。

在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。

分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。

为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。

它包括质量保证、质量控制和质量评估。

质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。

主要利用质量控制和质量评估。

质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。

对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。

质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。

其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。

当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。

因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。

FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。

目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。

2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。

流式细胞仪技术参数一、工作条件1、环境温度：10-30℃；2、相对湿度：15-80%；3、工作电压：220V.50Hz。

二、技术指标1、激光：488nm蓝色激光器，激光器功率≥50wm。

可升级加配638nm、405nm激光器。

激光器为全固态，持续非脉冲激发。

2、检测参数：前向散射光、侧向散射光、可以实现5色荧光的同时检测；3、光路系统：固定光路系统，不用每天调试；4、荧光检测敏感度：<30分子（FITC）/细胞；5、全峰宽变异系数:CV<3%；6、检测颗粒大小: 至少达到0.5um(min)-50um（max）；7、样本间自动清洗，携带污染率≤1.0%8、有国家SFDA注册证，仪器同厂家计数微球试剂有SFDA 注册证，可用于CD4绝对计数9、分析软件：全套分析软件，能终身免费升级；三、含自动进样器1、可用于流式细胞仪的自动上样系统；2、结合工作站电脑中预装的“工作表管理软件”和“自动进样管理软件”，仪器系统可自动完成数据的收集与分析工作；3、自动进样系统包含一个进样抽屉、电路模块、遥控按键和可容纳32以上个样本管的旋转样本盘。

四、基本配置1、流式细胞仪主机；2、全套分析软件；3、配置电脑：内存≥4 GB，硬盘≥256 GB独立显卡，windows 操作系统，要求与设备相匹配，并可处理存储充足的实验数据；23英寸液晶显示器，附彩色打印机1台；5、进口微量移液器一套（4只）。

6、稳压电源和变压器；血液混匀器一台7、技术资料：仪器全套电路图及中文操作手册、中华人民共和国医疗器械注册证；8、人员培训与技术支持：负责装机与人员培训，享受技术与维修服务。

包修一年，终身保修。

三年内免费调试校准。

流式细胞仪检测技术与质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。

该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。

本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。

当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法1.1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。

2 检测方法2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。

由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。

2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR 扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。

3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。

本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。

目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。

4 讨论流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。

流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。

流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。

用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。

经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。

这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。

光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。

单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。

一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。

流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。

它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。

流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。

本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。

工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。

它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。

当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。

通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。

检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。

它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。

流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。

荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。

散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。

散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。

生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。

生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。

质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。

质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。

设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。

光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。

每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。

数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。