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米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅林巧赵树东杨柳炜邓远均侯云境来源：《现代食品·上》2019年第03期摘要：本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化，分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明：蔗糖27g·L-1，硝酸钠2.5g·L-1，硫酸镁（MgSO4.7H20）0.6g·L-1，初始pH6.5，在30°C的环境下培养72h后，米曲霉生长得最好。
关键词：米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化中图分类号：TS201米曲霉（Aspergillusoryzae）是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一，其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
酱油的生产过程一般是原料处理、制曲、发酵、浸出淋油、加热灭菌、检测、包装等，在这些过程中，涉及各种微生物的作用。
因而近年来，越来越多的研究者对酱油酿造中的微生物群落进行研究，其中，霉菌是人们首要的研究对象，霉菌就有米曲霉、黑曲霉、红曲霉等。
米曲霉更是酱油酿造过程中的重中之重，它拥有极强分解蛋白质的能力和糖化淀粉的能力，在酿造酱油的过程中，就是用种曲培养米曲霉，等米曲霉不断繁殖大量后就会分泌出各式各样的酶，其中最多也最重要的就是淀粉酶和蛋白酶”。
鉴别产品品质、提高原料利用率及降低生产成本基本上是以把酶活性的高低作为参考之一。
实际上，提高米曲霉产蛋白酶活力不仅仅能够使原料的利用率得到提高，而且能够降低在酿造过程中对环境产生不良影响的概率，在工厂实际生产发挥了十分重要作用。
提高米曲霉产蛋白酶活力可以通过优化米曲霉培养基组成和培养条件实现。
1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种米曲霉3.042，由四川省生生酱园食品有限公司分离出的一株高产米曲霉。
1.1.2主要仪器及试剂电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）、乐祺电子天平（上海瑶新电子科技有限公司）、手提式不锈钢压力蒸气灭菌器、生物显微镜B204LED（重庆奥特光学仪器有限公司）、电热恒温隔水式培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）、游标卡尺、苏净安泰洁净工作台、电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、四门双机双温冷柜（产品型号：QBSL-09S，耗电量5.0kW）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
酱油中米曲霉酶系组成及其应用的研究进展
梁锦云;温林凤;李俊;扈圆舒;徐婷;刘占;符姜燕;曹庸
【期刊名称】《中国食品添加剂》
【年(卷),期】2024(35)3
【摘要】酱油是我国日常饮食的重要调味品,它由微生物发挥作用而形成。
其中米曲霉在酱油酿造过程中拥有巨大的应用价值和潜力,它不仅赋予酱油特殊的风味,而且产生一系列有利于其他微生物生长繁殖的化合物。
随着酱油发酵生产技术的不断改进与完善,对米曲霉酶学特征的研究更为迫切。
本文综述了近年来国内外关于酱油酿造中米曲霉的酶系组成研究及其应用进展,包括米曲霉的蛋白质降解酶、碳水化合物降解酶、细胞壁降解酶及膜降解酶等研究内容,为改善酱油酿造过程的原料利用率及酱油生产率提供了思路,也有利于酱油发酵工业的发展,提高经济收益。
【总页数】7页(P289-295)
【作者】梁锦云;温林凤;李俊;扈圆舒;徐婷;刘占;符姜燕;曹庸
【作者单位】华南农业大学食品学院;广东省功能食品活性物重点实验室;广东美味鲜调味食品有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS264.2;Q556
【相关文献】
1.酱油酿造过程中米曲霉酶系的影响因素
2.郫县豆瓣高酶活米曲霉选育鉴定及复合菌制曲改善酶系组成研究——郫县豆瓣复合菌制曲改善酶系组成研究
3.郫县豆瓣
高酶活米曲霉选育鉴定及复合菌制曲改善酶系组成研究——郫县豆瓣高酶活米曲霉的选育鉴定4.酱油酿造中米曲霉酶系的影响5.2株米曲霉的特色酶系对酱油理化指标及品质的影响
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多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的研究的开题报告题目：多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的研究背景：酱油是中国传统的调味品之一，有着悠久的历史和广泛的应用。
目前，酱油的生产主要分为两种方式：一种是自然发酵的传统制法，另一种是集中式工业化制法。
传统制法生产的酱油虽然口感独特，但是存在着生产周期长、品质不稳定等问题；而集中式工业化制品虽然生产效率高，但是酱油的风味与传统制品相比存在相对较大的差异。
近年来，随着生物技术的快速发展，利用微生物培养的方法制备酱油已成为研究热点之一。
目前，已经有多个国家利用生物技术优化酱油的制造工艺，从而获得更高质量的酱油产品。
研究内容：本研究将以多菌株制曲为基础，探究如何利用微生物的发酵技术提高酱油的品质。
具体的研究内容包括：1. 筛选出合适的微生物菌株：通过对多种微生物菌株进行筛选，找到最适合制备高质量酱油的菌株。
2. 优化发酵工艺：通过对多种发酵工艺进行比较，找到最适合菌株生长以及酱油口感的发酵工艺。
3. 提高酱油的质量：通过优化酶系等手段，提高酱油的品质，包括口感、香气等。
研究意义：本研究将应用生物技术的方法提高酱油的品质，具有一定的理论与实践意义。
另外，本研究的成果也将为相关企业的酱油生产提供一定的参考和借鉴价值。
研究方法：本研究将采用实验室实验和文献综述相结合的方法，利用微生物培养技术和生物化学等方法，对多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的关系进行深入分析。
预期结果：本研究将对多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的相关理论与实践问题进行深入探究。
预期结果包括酱油制品的质量提高、生产效率的提升以及理论上对于相关研究的深入探讨。
酱油生产中高产蛋白酶菌株米曲霉UF366发酵条件的研究傅力;章运;艾乃吐拉;赵艳雪;钱启龙;雷鸣【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2008(029)009【摘要】对高产蛋白酶菌株UF366米曲霉的种子培养基、制曲培养基以及发酵条件进行研究.结果表明:最适的种子培养基为麸皮、面粉和水,其比例为4∶1∶4,产生的孢子数最多,达到了167亿个/g;最适的制曲培养基为豆粕、麸皮、水,其比例为6∶4∶5;最佳发酵条件为培养温度33℃、培养时间32h、翻曲2次、接种量4‰,蛋白酶活力达到了1084U/g.【总页数】4页(P427-430)【作者】傅力;章运;艾乃吐拉;赵艳雪;钱启龙;雷鸣【作者单位】新疆农业大学食品科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局,新疆,乌鲁木齐,830002;新疆农业大学食品科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学食品科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学食品科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆七一酱园酿造食品有限责任公司,新疆,乌鲁木齐,830063【正文语种】中文【中图分类】TS264.2【相关文献】1.保靖酱油高产蛋白酶米曲霉菌种选育及产酶条件研究 [J], 黄伟;麻成金;黄群;王敬敬;逯与运2.米曲霉高产蛋白酶菌株的选育及在酱油酿造中的应用研究 [J], 傅力;章运;涂振东;叶凯3.米曲霉固体发酵生产中性蛋白酶产酶条件研究 [J], 苏龙;陈显玲;李家洲4.一株高产蛋白酶的米曲霉在酱油酿造中的发酵性能对比研究 [J], 黄艳;王静;高庭;童星5.高产蛋白酶米曲霉菌株的选育及对酱油风味生成的影响 [J], 樊嘉训;刘松;陆信曜;陈坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酱油酿造过程中微生物多样性分析方法摘要：酱油是我国的一种传统的咸味调味品，早在四千多年前的周朝，已有酱油生产的文字记载。
酱油的生产是利用各类微生物和酶的发酵作用完成，酱油发酵的微生物是如何发挥其发酵作用的呢，又是通过什么途径引入的?鉴于此，文章就酱油酿造过程中微生物多样性的应用进行了分析。
关键词：酱油酿造；微生物多样性；酱油品质在中国古代，酱油发酵(酿造)的微生物完全是由自然随机混入的，所以过去酱油酿造的首个工序是“制曲”，这样的目的就是为了引入发酵所需微生物，即采取自然界的霉菌(米曲霉)，古时称之为“采黄子”，制曲完成后，再拌入盐水进行发酵，在发酵过程中也完全依靠自然条件，通过“天然晒露”，引入空气中的细菌(乳酸菌)、酵母菌等微生物，长时间进行复杂的生化反应来完成的。
近代酱油酿造(发酵)则是选择特定的菌种进行培养，人为的添加纯种的霉菌(米曲霉或酱油曲霉)、乳酸菌、酵母菌等专用的微生物来酿造(发酵)的。
一、酿造酱油的优点酿造酱油不但味美，且含有益成分。
大量数据表明，亚洲国家的乳腺癌和子宫癌的发病率比欧美国家低，有专家认为，其主要原因是亚洲人食用酱油的比例较欧美国家高出30～50倍。
新加坡国立大学的一项研究发现，酿造酱油含有两种以上的抗氧化成分，而且各种成分消灭氧化自由基的时间长短不一样，有助于减少自由基对人体的损害，其功效比维生素C和维生素E等高十几倍，而且酱油能较长时间地消灭自由基，因此，从“抗自由基”的角度分析，酱油具有较好的防癌、抗癌功效。
医学研究还证实，人体内的雌激素水平过高可能会导致乳腺癌和子宫癌的发生，而酱油中的有益成分之一便是大豆中所含的异黄酮，它能抑制人体内雌激素的作用，因而具有减缓，甚至抑制这些恶性肿瘤生长的作用；同时，异黄酮还可以阻止新生血管的形成，从而使需要依赖新生血管输送养分的恶性肿瘤细胞死亡。
异黄酮还可降低人体内的胆固醇，减少患心血管疾病的危险。
二、酱油的养分成分酵母菌含18种氨基酸和呈味核苷酸，富含丰富的维生素B、克酸、生物素及对人体有利的微量元素，是一种营养型的调味料。
酱油生产中应用米曲霉和黑曲霉混合制曲的探索李保英;姜佳丽;蒋予箭【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2011(000)012【摘要】该文考察了米曲霉和黑曲霉在单独制曲及混合制曲条件下,成曲的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、糖化酶及孢子数,探讨了酱油多菌种制曲的可行性.实验以豆粕、麸皮为原料,以AS3.042米曲霉、AS3.350黑曲霉为菌种,探讨了2种制曲方式及不同配比制曲效果的影响.结果表明,米、黑曲霉分开制曲比混合接种制曲所得成曲效果好,米、黑曲霉分别以33℃制曲42h、48h得成品曲,再以2∶1混合所得成曲可获得较佳的酶活力,曲料总蛋白酶活力2748U/g与对照值相当,而酸性蛋白酶及糖化酶活力分别达712U/g、1090U/g,较对照分别提高55.8％、25.4％.【总页数】5页(P70-74)【作者】李保英;姜佳丽;蒋予箭【作者单位】浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州310012;浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州310012;浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州310012【正文语种】中文【中图分类】TS264.2【相关文献】1.双菌种混合制曲在酱油生产上的应用 [J], 曹景滇2.解淀粉芽孢杆菌SWJS22和米曲霉混合制曲酱油发酵中的应用 [J], 赵龙;周池虹伶;赵谋明;崔春;王炜3.在酱油生产中应用双菌种制曲的探索 [J], 李琴;杜风刚4.双菌种混合制曲在酱油生产上的应用 [J], 曹景滇5.一株高酶活力米曲霉菌株的选育及其在酱油生产中的应用 [J], 童星;彭勃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
1. 掌握酱油中菌种的提取方法。
2. 了解酱油菌种的特性及其在酱油酿造中的作用。
3. 学习微生物分离纯化的基本操作技术。
二、实验原理酱油酿造过程中，多种微生物的协同作用是关键。
其中，曲霉、酵母菌和乳酸菌等菌种在酱油的风味形成、香气产生和品质改善等方面发挥着重要作用。
本实验旨在从酱油中提取这些菌种，为后续研究提供菌种资源。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酱油样品- 琼脂糖- 蒸馏水- 无菌器械（无菌镊子、无菌移液器等）- 无菌培养箱- 显微镜- 恒温水浴锅2. 实验仪器：- 电子天平- 烧杯- 离心机- 移液器- 灭菌锅- 酶联免疫检测仪1. 菌种提取：（1）称取适量酱油样品，加入适量蒸馏水，充分搅拌均匀。
（2）将混合液用无菌器械进行过滤，去除大颗粒物质。
（3）将滤液离心，弃去上清液，收集沉淀。
（4）将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（5）将洗涤后的沉淀重新悬浮于适量蒸馏水中，得到菌悬液。
2. 菌种分离纯化：（1）将琼脂糖融化后，加入适量的菌悬液，混匀。
（2）将混合液倒入无菌平板中，待凝固后，用无菌接种环取少量菌悬液，涂布于平板表面。
（3）将平板放入培养箱中，37℃培养24小时。
（4）观察菌落生长情况，挑取单菌落，进行纯化培养。
3. 菌种鉴定：（1）将纯化后的菌种进行形态观察，包括菌落形状、颜色、大小等。
（2）进行生化试验，如糖发酵试验、酸碱反应等，以鉴定菌种类型。
（3）利用PCR技术，对菌种进行基因序列分析，进一步确定菌种种类。
五、实验结果与分析1. 菌种提取：本实验成功从酱油中提取了菌种，菌悬液颜色呈金黄色，表明菌种数量较多。
2. 菌种分离纯化：通过涂布分离，成功分离出多个单菌落，表明酱油中存在多种菌种。
3. 菌种鉴定：通过形态观察和生化试验，初步鉴定出酱油中的菌种包括曲霉、酵母菌和乳酸菌等。
通过PCR技术，进一步确定菌种种类，为后续研究提供了菌种资源。
六、实验结论1. 本实验成功从酱油中提取了菌种，为后续研究提供了菌种资源。
酿造酱油的微生物发酵和酵母菌选择研究酱油是一种长久流传的传统调味品，被广泛应用于亚洲菜肴中。
其独特的香味和口感，离不开微生物发酵过程中的酵母菌选择。
本文将探讨酿造酱油的微生物发酵和酵母菌选择的研究内容。
酿造酱油的微生物发酵是一个复杂而精细的过程。
酿造酱油所需的微生物主要有酵母菌和乳酸菌。
这两类微生物在酿造酱油过程中起着不可或缺的作用。
首先，酵母菌是酿造酱油的主要酶源。
酵母菌主要发挥其产酶能力，通过将淀粉、蛋白质和油脂等复杂有机物质分解为简单的糖类、氨基酸和脂肪酸。
在酿造酱油的发酵过程中，酵母菌能够分解豆类中的蛋白质，生成氨基酸，为酱油的味道和香气增添了独特的风味。
其次，乳酸菌在酿造酱油中起到了调节微生物菌群平衡的作用。
乳酸菌主要以糖类为底物进行发酵，产生乳酸。
乳酸的产生能够降低发酵液的PH值，调节菌群中酵母菌和细菌的生长条件，使酿造过程更加稳定。
酿造酱油的微生物发酵中，酵母菌的选择是十分关键的。
目前，常用的酿酱油酵母菌主要有曲酵母、醪糟酵母和毛亚酵母等。
不同的酵母菌在酿造酱油中表现出不同的特点和特性。
曲酵母是一种常见的酿造酱油用酵母菌，其在发酵过程中能够产生较高的酵母酸和丙酮酸。
这两种有机酸是酿造酱油过程中的重要成分，能够产生特殊的香气和口感。
曲酵母还能够产生具有抗菌作用的物质，有助于酱油的保藏和品质稳定。
醪糟酵母在酿造酱油中也具有重要的地位。
该种酵母菌在发酵过程中能够产生乳酸、醋酸和举例等有机酸，为酱油的口感和风味增添了独特的特点。
醪糟酵母的特殊代谢产物还能够改善酱油的风味和质量，使其更加浓郁和鲜美。
毛亚酵母是一种新兴的优质酿造酱油用酵母菌。
该种酵母菌具有较高的胞外酶活性和发酵产乙醇的能力。
毛亚酵母能够遗传稳定，抗菌，对环境适应性强，对变温变酸性等因子具有一定的耐受能力。
在酱油酿造中，毛亚酵母仍然存在潜力可以进一步发掘和应用。
此外，酿造酱油的微生物发酵过程中还需要控制温度、湿度和PH值等条件，以保证微生物的活性和最终产品的品质。
米曲霉——发酵好酱油的关键发酵网米曲霉米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
影响米曲霉系的因素影响米曲霉酶系形成、作用的因素主要有：1．曲料：曲料米曲霉的菌丝由多细胞组成，具有产酶功能，菌丝体在曲料上生长好坏直接关系到其酶系的形成和酶活性的强弱。
酱油制曲过程的实质就是要创造米曲霉生长的最适宜条件，保证米曲霉充分发育繁殖，分泌出酿造酱油所需的各种酶类。
所以制曲原料的选择、处理和配比要严格把关。
曲料要以蛋白质含量较高、碳水化合物适量为原则进行选择配比。
曲料的处理要注意以下几点：1。
粉碎要适度。
颗粒太粗，会减少米曲霉生长繁殖的总面积，降低酶活力；颗粒太细，润水后容易结块，蒸料时会产生夹心，导致制曲通风不畅，不利于米曲霉的生长。
2。
中图分类号：TS201.3；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2004)01-0005-012从酱油生产用菌粉中选诱优良米曲霉菌种的研究周传云 聂明 万佳蓉（湖南农业大学食品科技学院，长沙410128）摘要：以酱油酿造用菌粉为出发菌（S），经分离、纯化后再经紫外线诱变（15W，20cm，30min）及控温培养处理后，获得1株变异菌株。
结果表明：能在44℃环境中旺盛生长；酶活力可达8158.6u/g（干曲），较出发菌株S酶活力提高了77.84%；遗传稳定性较好；发酵成酱油后经测定，其指标可达“GB18186—2000低盐固态发酵酱油”特级品，明显优于出发菌株酿造的酱油。
关键词：米曲霉；菌种诱变；酱油酿造酱油酿造过程中主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系，分解原料中的多种成分，从而形成酱油独特的色、香、味、体[1]。
可见，米曲霉菌种的好坏直接关系到酱油的产量和质量。
优良的菌种往往在生产中因反复接种、传代及保藏不善等，特别是在高温情况下，常会出现污染杂菌、性状退化等而导致其生产性能下降乃至不能生产。
因而，对生产菌种有目的地进行分离筛选、诱变处理，从而筛选出生长速度快、孢子数量多、酶活力高，并且不易被杂菌污染的菌株用于生产，这无疑将会给企业带来巨大的新的活力。
本研究以市购酱油生产用孢子粉为材料，进行分离纯化，获得纯菌株后再经紫外线诱变，筛选获得了一株理想的米曲霉菌株。
1 材料与方法1.1 材料供试菌:上海某酿造厂生产的酱油曲粉，本试验将其分离、纯化后编号为S，作诱变出发菌株。
市购。
主要原材料:麸皮、豆粕、食盐等均市购诱变剂:紫外线:由从市场新购置的15W的紫外灯产生。
分离纯化及菌种保存用培养基:PDA培养基初筛蛋白酶活力用培养基（干酪素平板）:干酪素4g、KH2PO4 0.36g、Na2HPO4 1.07g、ZnCl2 0.014g、收稿日期：2003-10-5周传云，男，1947，2生，副教授，长期从事食品微生物、食品发酵等教学、科研、生产工作。
“湖南派派食品有限公司”技术创始人，主持研制、生产“派派酸牛奶”、“派仔腊八豆”系列产品 NaCl 1.2g、CaCl2 0.002g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.002g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH6.5～7.0、121℃灭菌30min。
麸皮菌种培养基(同时供复筛用):豆粕9g、麸皮1g、水11ml，装入250ml的三角瓶，121℃灭菌30min。
酿造酱油用原料:豆粕1600g、麸皮400g、水2200ml、121℃灭菌30min。
1.2 主要仪器与设备滴定管、凯氏定氮仪、陶瓷发酵罐及三角瓶、试管、培养皿等常规玻璃器皿。
电子天平、无菌操作台、台式振荡器、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温水浴箱、723型分光光度计、显微镜、血球计数板等。
1.3 方法1.3.1 菌种分离纯化采用常规“稀释平板涂抹法”[2]与“稀释平板划线法”[2]等两种方法同时对供试菌进行分离纯化，挑取生长速度最快、产孢子量最致密，表面颜色最一致个体形态无异的单个纯菌落一个，移入PDA斜面培养好后备用(即为出发株S)。
1.3.2 孢子悬液制备取2环S菌株的孢子于盛有100ml并含有玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶中，振荡20min，得单孢子悬液。
用血球计数板计数其孢子含量，并用无菌生理盐水调整孢子悬浮液浓度分别为105个/1ml、104个/1ml、103个/1ml，并置32℃温箱中培养6 h 后置于4℃冰箱备用。
1.3.3 诱变程序出发菌→制备孢子悬液→制备含菌平板诱变处理→初筛→复筛→发酵性能测定→生产菌株1.3.4 诱变方法[2]各取备好的孢子悬液10ml，放入6个9cm直径的无菌玻璃培养皿中，在磁力搅拌作用下，用紫外灯（15w，20cm距离）取3个不同时间（10min、20min、30min即不同剂量）分别进行照射处理，然后取处理液各0.1ml，涂布于PDA平板表面，每个剂量用3个含菌平板，并立即用黑牛皮纸包扎好（避光），倒置于32℃恒温培养箱中培养3d，对每个平板的菌落数及致死率进行统计，取致死率在99%以上的单个孤立菌落移入PDA斜面，每个菌落5支，培养，备用。
1.3.5 照射菌株的筛选[2]干酪素平板水解透明圈初筛法：分别从上述照射处理后的PDA斜面上取极少量孢子进行稀释，并用血球计数板测定稀释至1010个孢子/1ml稀释液，取1滴于干酪素平板表面，用玻璃刮铲涂抹均匀，置32℃培养2d，分别测定每皿中透明圈直径和菌落直径（均以每皿中3个菌落的平均数计为该变异株的结果），计算HE值。
HE值=透明圈直径/菌落直径，选择HE值较大的菌株移入PDA斜面，培养3d，备用。
控温培养筛选法：将经过初筛后所得菌株分别取少许孢子按上述方法稀释至1010个孢子/1ml，取0.1ml涂布于干酪素平板表面，每株用平板24个，分别置于34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃等8个不同温度下均培养3d（每个处理设2个平行样，另设1个出发株平板），观察生长情况及孢子致密状况，并分别测定所生长菌落直径及其透明圈直径，按初筛方法计算出HE值，选择能在最高温度中生长而且HE值较大的菌株移植于PDA斜面，用相应温度培养好后，保存以备进行蛋白酶活力测定复筛。
1.3.6 蛋白酶活力测定：Folin—酚法[2]固态发酵制酶：将经过初筛后所得菌株，分别接种于三角瓶麸皮菌种培养基内，于相应温度恒温箱中培养72h，测定蛋白酶活力。
蛋白酶活力测定：准确称取鲜曲2.00g于内置玻璃珠若干粒的干净三角瓶内，加蒸馏水50ml，振摇三角瓶20min以便将曲充分打散，于40℃水浴中恒温浸提1h，用定性滤纸过滤去渣得酶液。
酶液用pH7.2的0.2mol/L磷酸缓冲液进行适当稀释。
40℃测酶活力，723型分光光度计680nm比色。
同时测定鲜曲水分含量。
蛋白酶活力单位：在40℃，pH7.2条件下，每min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（u）。
1.4 酱油的酿造1.4.1 方法：低盐固态法[1]1.4.2 流程原料（豆粕:麸皮=8:2）→粉碎（2～3mm/粒）→混料、润料（料:水=1:1.1）→蒸料（121℃，45min）→摊凉℃(40)→接种（三角瓶种曲）→通风培养（38℃，48～72h）→成曲+盐水（含13%的盐水6300ml）→保温发酵（先用45℃保温发酵7d，后用32℃保温发酵10d）→浸泡、淋油、过滤→取清液装瓶→巴氏杀菌→检测1.4.3 酱油测定按GB18186-2000《酿造酱油》[3]标准要求进行2 结果与分析2.1 紫外线诱变致死结果将S纯菌株经紫外线不同剂量照射处理后，其致死情况见表1（剂量：照射时间min）。
表1 紫外线诱变致死情况统计表（%）剂量10-3 10-4 10-5存活率致死率存活率致死率存活率致死率0 100 0 100 0 100010 15 85 25 75 20 8020 10 90 5 95 8 9230 1 99 0.6 99.4 0.3 99.7从表1结果看出，照射30min的致死率均在99%以上，为了确保优良菌株不漏选，本研究从致死率达99%以上的处理中各选取3个生长速度快、孢子致密的菌落移入PDA斜面每个菌落2支培养好备用（编号为U1~U9）2.2 紫外线照射菌株干酪素平板初筛结果将诱变后挑选出的菌株涂布于干酪素平板，经培养后，其结果见表2。
表2 诱变株干酪素平板初筛结果编号S U1U2U3U4U5U6U7U8U9HE值1.451.70 1.78 1.69 1.90 2.08 2.18 1.91 1.76 2.36从表2可看出变异株的HE值均高于出发株的HE值，于是从9株变异菌株中挑选出EH最大的3株进行控温培养筛选，即：U5（HE=2.08）、U6（HE=2.18）、U9（HE=2.36）。
2.3 控温培养筛选结果表3 变异菌株在不同温度下培养的HE 值34℃ 36℃ 38℃ 40℃42℃ 44℃ 46℃48℃S 1.35 1.30 0.96 0.6 0.2 0 0 0 U 9 2.35 2.28 2.32 2.30 2.38 2.40 1.800.4U 6 2.08 1.88 1.64 1.50 1.20 0.81 0.400 U 5 2.15 1.92 1.65 1.481.10 0.71 0.30将上述初筛所得3株变异菌株再接种于干酪素平板进行不同温度培养处理，其结果见表3所示:诱变株的耐温性能明显优于出发株，出发株在44℃时便不能生长，而U 9诱变株到48℃时尚能生长，这无疑给酱油生产制曲带来极大好处。
2.4 蛋白酶活力测定结果将诱变株经麸曲固态培养后，测定其蛋白酶活力结果见表4～5。
表4 诱变株蛋白酶活力测定结果 (u/g)菌 株 S U 9U 6U 5酶活(干曲)4587.6 8158.6 6215.8 6173.6从表4可以看出U 9的酶活最高（8158.6），较出发株酶活（4587.6）提高了3571（将近77.84%），这与平板初筛及控温培养结果一致，同时根据控温培养的观察，各参试菌株的生长速度、孢子密度及耐温性等均是：U 9＞U 6＞U 5＞出发株，故确定U 9变异株进行下一步试验。
同时从下面表5的结果还可看出：菌落直径大的HE 值大，酶活也高。
表5 菌株菌落直径和HE 值与产酶能力关系 菌 株 S U 9U 6U 5菌落直径(mm) 13.5 21.2 19.6 18.7 HE 值1.412.28 2.10 1.96 蛋白酶活力(μ/g) 4587.6 8158.6 6215.8 6173.62.5 U9诱变株遗传稳定性试验结果将U 9进行6次试管斜面传代培养，每移代一次同时进行发酵产酶，测其酶活性，结果见表6。
表6 不同传代数发酵产酶结果 u/g（干曲） 代数1 2 3 4 5 6 酶活 8211.78217.0 8198.6 8199.7 8205.6 8091.7从表6看出，经6次传代培养后，U 9的酶活基本没有多大变化，且其菌丝生长速度、孢子的致密度也基本无变化，这说明U 9的遗传性能稳定。
2.6 生产性能测定综上所述结果分析，本研究选定诱变株U 9采用“低盐固态法”酿造酱油，其结果见表7~8。
表7 成曲培养结果杂菌数 (CFU·G-1)孢子数 (个/g)蛋白酶活力 (u/g) 水分含量(%)出发株S 3.9×105 4.8×109 4236.5 34 诱变株U 92.5×102 6.7×1010 7963.727从表7可看出，酿制酱油时，成曲的几项主要指标诱变株U 9均优于出发株S ，这为酿造优质酱油打下了良好的基础。
