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抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
细胞活性检测方法细胞活性检测方法主要用于评估细胞的生存和功能状态，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、环境监测等领域。
目前，细胞活性检测方法主要可以分为细胞形态学观察方法、细胞色素检测方法、细胞代谢活性检测方法、细胞增殖检测方法和细胞毒性检测方法等。
细胞形态学观察方法是通过显微镜观察细胞的形态、结构和运动等来评估细胞的活性。
常用的方法有细胞染色、免疫细胞化学染色、电子显微镜观察等。
细胞染色常用的方法有吉姆萨染色、伊红染色、达科显色等，通过染色剂与细胞器和细胞成分的特异性反应，可以评估细胞的形态和结构是否正常。
免疫细胞化学染色则是利用抗体与特定蛋白结合，通过免疫反应染色的位置和强度来评估细胞中特定蛋白的分布以及相关的细胞活性。
电子显微镜观察可以提供更高分辨率的细胞形态和结构信息。
细胞色素检测方法主要用于评估细胞中某些特定酶或分子的活性水平。
例如，青蛙卵中的细胞色素-c还原酶活性检测是通过测定细胞中细胞色素-c的还原酶活性来评估细胞的呼吸功能。
此外，细胞色素琥珀酸酶、醛酮还原酶、过氧化物酶等也是常用的酶活性检测指标。
这些方法主要通过测定细胞中特定酶的底物转化产物的生成量或底物消耗量来间接评估细胞中该酶的活性水平。
细胞代谢活性检测方法是通过测定细胞中一些代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
例如，细胞呼吸活性检测方法可以通过测定细胞中耗氧量或产生的二氧化碳量来评估细胞的呼吸代谢活性。
蛋白质、核酸和糖类代谢等也可以通过测定细胞中相关代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
细胞增殖检测方法主要用于评估细胞的增殖能力。
常用的方法有细胞计数、增殖染料标记和细胞周期分析等。
细胞计数是通过手动显微镜观察或自动计数器进行的，可以定量评估细胞的增殖数目。
增殖染料标记则是利用细胞内染料的稳定性或代谢产物的积累来评估细胞的增殖活性。
细胞周期分析是通过流式细胞术来确定细胞在G0/G1、S和G2/M等不同细胞周期阶段的比例，从而评估细胞的增殖能力。
生物活性分子的分离和鉴定方法探究随着科学技术的发展，人类对生物活性分子的研究日益深入。
生物活性分子是指在生物体内或生物过程中起重要调节作用的分子，如激素、酶、抗体等。
它们的分离和鉴定是生物学、医学、药学等领域研究的重点。
本文将对生物活性分子的分离和鉴定方法进行探究。
一、分离方法1、层析法层析法是一种基于化学物理性质的分离方法，可用于分离具有不同性质的生物活性分子。
它根据分子在不同介质中的亲疏性、极性、电荷等性质进行分离。
常见的层析法包括凝胶、离子交换、亲和、逆相等。
凝胶层析法是一种按照分子大小分离的方法。
它将样品加入凝胶柱中，样品中的分子将在凝胶中缓慢通过，不同尺寸的分子经过减速效应后分别通过柱床。
离子交换层析法是一种按电荷分离的方法。
它利用样品中分子带有不同电荷的特性，通过具有不同电荷的离子交换树脂分离目标分子。
亲和层析法是一种按化学特性分离的方法。
它通过利用目标分子与树脂之间亲和力的差异，使目标分子精确分离。
逆相层析法是一种按疏水性分离的方法。
它利用碳链疏水和极性官能团亲疏性的差异，分离具有不同疏水性的分子。
2、电泳法电泳法是一种基于电荷和大小的分离方法。
它利用外部电场对带电分子的作用，使具有不同电荷和大小的生物活性分子在电泳介质中以不同速度迁移。
常见的电泳法包括蛋白质电泳、核酸电泳等。
蛋白质电泳法是一种将蛋白质按大小和电荷分离的方法。
电泳介质中的一定电场下，不同带电量、电荷分布、分子形态和大小的蛋白质会在介质中形成带，从而实现蛋白质的分离。
核酸电泳法是一种按大小和电荷分离DNA和RNA的方法。
它将核酸样品与电泳缓冲液注入凝胶槽内，通过外界电场使具有不同分子大小和电荷的DNA或RNA在凝胶中快速迁移。
二、鉴定方法1、质谱法质谱法是一种通过分析物质质量、分析分子结构和杂质成分的方法。
它对生物活性分子进行分析时，既可利用生物大分子质谱学如大质量串联谱（LC-MS）、基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），也可以利用小分子质谱分析如气质联用质谱（GC-MS）和高效液相色谱质谱（HPLC-MS）等。
具有细胞伤害性的生物活性测定法一、生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1、细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生zhang因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生zhang、IL-3 ci激肥大细胞生zhang、IL-6 ci 激浆细胞生zhang等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株(简称依赖株)。
这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外zhang期培养。
在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2、靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。
通常靶细胞多选择体外zhang期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3、细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可ci激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。
通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4、细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
检测酶的活性的方法
有许多方法可以检测酶的活性，以下列举了几种常见的方法：
1. 光度法（spectrophotometry）：该方法测量在酶催化下产生的化学反应的光学性质变化，例如吸光度或荧光强度的变化。
通过测量反应体系中的光学信号，可以推断酶的活性。
2. 比色法（colorimetry）：该方法通过测量在酶催化下产生的产物或底物的颜色变化来确定酶活性。
通过将反应体系加入适当的底物和试剂，酶催化的产物会导致溶液颜色的变化，可以通过光学检测方法来测量和分析产物的含量。
3. 标记底物法（labeled substrate assay）：该方法利用带有特定标记的底物，例如放射性同位素或荧光染料。
酶催化底物的反应会导致标记物的释放或改变，从而可以通过测量标记物的数量来推断酶的活性。
4. 电化学法（electrochemistry）：该方法利用酶催化电化学反应导致电流或电势的变化来检测酶的活性。
常见的技术包括循环伏安法（cyclic voltammetry）和电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy）等。
5. 放射性测量法（radiometric assay）：该方法利用酶催化底物与放射性同位素结合，通过测量底物的放射性衰变来确定酶的活性。
6. 质谱法（mass spectrometry）：该方法利用质谱技术分析酶催化反应产生的气相或溶液中的离子组成。
可以通过检测反应体系中特定的离子峰来推断酶的活性。
以上只是部分常见的酶活性检测方法，具体的方法选择取决于研究的酶类型、底物和实验条件等因素。
细胞活性测定方法细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1.MTT法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
2.XTT法XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。
当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。
蛋白的生物活性测定方法（结晶紫法和MTT法）结晶紫法活性测定1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。
进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。
接种于96孔细胞培养板，100µl/孔。
接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。
96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ ml，配成样品稀释液。
取此稀释液900µl至Eppendorf管中，另在9个5m l管中加入700µl稀释液。
3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至100 0µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl 至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。
再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复 n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。
4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。
再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl 稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。
5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。
