实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法

琼脂打孔法抑菌圈试验琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）⼀、试验原理利⽤抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显⽰其抑菌作⽤。

试验通过抑菌圈⼤⼩以判断其是否具有抑菌能⼒。

本试验适⽤于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

⼆、试验器材、化学试剂及菌种培养⽫、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离⼼管、游标卡尺、涂布棒、麦⽒⽐浊管、电动混合器、⽔浴锅、超净⼯作台、⾼压灭菌锅、⿎风⼲燥箱、⽣化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、⽆菌⽔、95%⼄醇。

菌种：溶⾎性链球菌、溶⾎性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、⽩喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、⼤肠杆菌三、试验步骤1、实验⼯器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，⽤电热炉加热煮沸⾄澄清状态，盖好塞⼦，同PBS 缓冲液、⽆菌⽔、配套枪头、涂布棒、离⼼管⼀同放⼊⾼压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。

将培养⽫⽤⽜⽪纸包好和试管⼀起放⼊⿎风⼲燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。

实验前超净⼯作台及操作室使⽤前需⽤紫外灯杀菌30min以上。

2、倒培养⽫将培养基及培养⽫放置到60℃后开始倒培养⽫，培养基使⽤前摇匀，每个培养⽫倒15～20mL左右，倒好后⽔平静置⾄完全凝固。

3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加⼊5mL 的PBS缓冲液将斜⾯上，在⼿掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒⼊试管中轻轻摇匀。

吸取1mL 的菌液加⼊到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进⾏5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢⼦悬浮液（对⽐0.5麦⽒⽐浊管），将选好的菌悬液⼗倍系列稀释后选第⼆⽀试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢⼦悬浮液）进⾏试验。

4、试验菌的接种⽤移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养⽫内，⽤涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使⽤后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养⽫。

日化产品长效抑菌效果的评价方法一、微生物培养法微生物培养法是通过将一定量的日化产品加入培养基中，然后接种微生物，在一定温度下培养一段时间后，观察和测量生长的菌落数来评价抑菌效果。

该方法可以直观地反映微生物的生长情况，从而判断抑菌效果。

二、抑菌圈法抑菌圈法是在琼脂平板上划线接种已知菌种，然后将待测的日化产品涂布于平板上，观察抑菌圈的大小来判断抑菌效果。

该方法简单易行，适用于表面抑菌剂效果的测定。

三、重量法重量法是通过测量抑菌前后样品的质量变化来评价抑菌效果。

该方法适用于能够去除微生物的日化产品效果的测定，如某些洗手液、清洁剂等。

四、表面观察法表面观察法是通过观察实验前后样品表面的变化来判断抑菌效果。

该方法适用于表面杀菌剂效果的测定，如某些消毒液、抗菌湿巾等。

五、残留量法残留量法是通过测量抑菌后样品中有效成分的残留量来判断抑菌效果。

该方法适用于能够定量检测有效成分的日化产品效果的测定。

六、计时法计时法是在一定的时间内，观察抑菌剂对微生物生长的抑制作用，通过比较抑菌剂处理组和对照组微生物的生长情况来判断抑菌效果。

该方法适用于能够观察到微生物生长变化的抑菌剂效果的测定。

七、反复实验法反复实验法是在相同条件下进行多次重复实验，取平均值作为实验结果，以提高实验的准确性和可靠性。

该方法适用于任何需要重复实验的抑菌剂效果的测定。

八、质量控制法质量控制法是通过建立质量控制标准，对实验全过程进行质量监控，以保证实验结果的准确性和可靠性。

该方法适用于任何需要保证实验质量的抑菌剂效果的测定。

九、微生物计数法微生物计数法是通过在琼脂平板上接种一定量的待测微生物样品，在一定温度下培养一段时间后，对菌落进行计数来判断抑菌效果。

该方法适用于能够进行微生物计数的抑菌剂效果的测定。

2.1.1制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。

取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。

经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

2.1.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。

同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。

切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

检测某个样品的抑菌活性时间观察1.把实验室用的普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121度，20分钟）。

2.将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取1ml该菌悬液至灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，倒入适量（约4毫米厚吧）已灭菌的培养基（温度约45度，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。

3.将用于试验的农药配制成几个所需的浓度，用无菌镊子夹起一片滤纸放入药液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基的中心，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴。

4.按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。

5.在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小，计算抑菌率就OK了！细菌素抗菌活性的检测采用牛津杯法。

双碟的制备：取直径90mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂（1.5%）15mL，水平放置使之凝固，作为底层，取指示菌培养基（浓度为0.8%，冷却至50℃）与指示菌菌液适量混匀，取6ml。

铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。

用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。

在牛津杯中加满相同量的抗菌液（300uL），每个样品3个重复。

将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养18h后（其中以真菌做指示菌的培养时间为30℃、3d）取出测量抑菌圈直径。

琼脂扩散法：先将指示菌固体培养基融化，冷却后倒平板。

待平板凝固后，均匀放入牛津杯。

再将指示菌半固体培养基融化，冷却至45～50℃，把指示菌液先稀释至10°后，吸取50uL接入指示菌半固体培养基中，倒平板。

待平板凝固后将牛津杯拔出，在孔中加入50uL 发酵液。

30℃培养24h，观察有无抑菌圈产生。

八宝景天抑菌活性实验方案1 材料与仪器1.1 材料八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。

1.2 微生物真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。

番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。

1.3 试剂与仪器95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司马铃薯JFSD-100粉碎机上海淀久中药机械制造有限公司JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂RE-2000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂TDL-5A低速大容量离心机上海悦丰仪器仪表有限公司生化培养箱SPX-250型上海跃进医疗器械厂ZKF035电热真空干燥箱上海实验仪器厂有限公司KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司不锈钢手提式灭菌器上海申安医疗器械厂超净工作台上海生物科技有限公司1.4 培养基的制备真菌都用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖20g琼脂20g水1000mL pH值自然培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管或锥形瓶中。

生物制药工艺实验,抑菌圈的大小
抑菌圈和抑菌物质浓度的对数是成正比的，也就是抑菌物质浓度越高，抑菌圈越大。

抑菌物质浓度一直稀释下去，则抑菌圈直径逐渐变小，直到没有抑菌圈出现，这个临界浓度就是MIC。

如果你的实验没有出现抑菌圈，说明抑菌物质浓度不高。

说明你做的抑菌物质浓度在临界浓度范围内，如果你做的是梯度抑制实验，则说明你的结果有意义，如果是固定浓度，那么久很难说明原因了。

抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式丰要用于测定杀菌
防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。

通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌
防霉剂品种。

抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。

原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。

影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。

操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。

将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。

用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。

记录抑菌圈的直径，实验。

重复10次。

主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。

（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。

抑菌试验中抑菌圈法的比较研究抑菌圈法是一种常用的抑菌试验方法，可以用来测定样品对微生物的抑制活性。

相比传统的微生物抑菌方法，抑菌圈法具有更高的敏感性和准确性。

本文将对抑菌圈法和传统法进行比较研究，以期为相关领域的研究提供参考。

抑菌圈法具有较高的抑菌效果，能够更准确地反映样品对微生物的抑制活性。

相比传统法，抑菌圈法更能敏感地检测出样品的微弱抑菌作用。

这是因为抑菌圈法是通过测量抑菌圈的直径来计算抑菌效果，可以更直观地反映微生物的生长情况。

传统法操作相对简单，对实验设备要求不高，因此适用于一些条件较差的实验室。

而抑菌圈法需要用到精密的培养皿和移液器等设备，操作相对复杂，但可以通过自动化设备减轻工作量。

抑菌圈法具有更高的灵敏度，能够更准确地检测出样品的抑菌效果。

传统法往往需要大量的样品才能达到较好的抑菌效果，而抑菌圈法则只需要少量的样品即可。

抑菌圈法还可以通过观察抑菌圈的颜色和透明度等指标来评估样品的抑菌效果。

通过对抑菌圈法和传统法的比较研究，可以得出以下抑菌圈法在抑菌效果、操作简便性和灵敏度等方面均优于传统法。

尤其是在对样品进行微弱抑菌活性检测时，抑菌圈法具有更高的准确性和可靠性。

因此，在需要进行高精度和敏感度的抑菌试验时，建议采用抑菌圈法。

然而，对于一些条件较差的实验室，传统法仍然是一种可行且实用的选择。

在未来的研究中，可以进一步探讨抑菌圈法的应用范围和局限性，以及如何通过改进实验条件和优化实验方案来提高其准确性和可操作性。

对于传统法，也可以研究如何通过改进实验设备和优化实验流程来提高其准确性和灵敏度，从而为相关领域的研究提供更多有益的信息。

抑菌圈法和传统法各有其优点和适用范围。

在进行抑菌试验时，应根据具体的研究目的、样品性质和实验室条件来选择合适的实验方法，以提高研究结果的准确性和可靠性。

随着人们对健康的度不断提高，家用抑菌型洗涤产品在市场上越来越受到欢迎。

这些产品宣称可以有效地杀灭细菌和病毒，保护家人免受疾病困扰。

生物活性杀菌剂的杀菌效果评估与改进研究生物活性杀菌剂是一种通过抑制或杀灭病原微生物来保护农作物免受疾病侵袭的农药。

随着农药使用量的增加，一些病原微生物对常规杀菌剂产生了抗药性，因此需要对生物活性杀菌剂的杀菌效果进行评估与改进研究，以提高农作物防病效果。

生物活性杀菌剂的杀菌效果评估主要通过以下几个方面进行：1.抑菌环实验：将生物活性杀菌剂溶解在琼脂中，制成一定浓度的琼脂平板，然后在平板上均匀涂布病原菌，观察生物活性杀菌剂对病原菌的生长抑制效果。

2.活菌数计数方法：通过制备生物活性杀菌剂的不同浓度溶液，接种病原菌悬浮液，定时取样，每次取样通过稀释平板计数方法，计算出生物活性杀菌剂对病原菌的杀菌效果。

3.根际抑制效应评估：将生物活性杀菌剂喷施在植物根系周围，观察病原菌在植物根际的存活情况，评估生物活性杀菌剂对病原菌根际侵染的抑制效果。

改进研究方面，主要从以下几个方面进行：1.杀菌机理研究：通过研究生物活性杀菌剂对病原菌的作用机理，深入了解其抑制病原菌生长的原理，进而找到改进杀菌效果的途径。

2.优化配方研究：通过改变生物活性杀菌剂的配方，如添加辅助剂、改变pH值等，优化其杀菌效果，提高其稳定性和持效性。

3.杀菌剂之间的协同作用研究：通过研究不同生物活性杀菌剂之间的协同作用，找到最佳的配比和配伍方式，提高杀菌效果。

4.抗药性研究：研究生物活性杀菌剂可能引发的抗药性问题，探索减轻或避免抗药性的途径，保持生物活性杀菌剂的持久杀菌效果。

总之，生物活性杀菌剂的杀菌效果评估与改进研究是提高农作物防病效果的关键。

通过深入研究生物活性杀菌剂的杀菌机理，优化其配方和协同作用，并充分考虑抗药性问题，可以提高生物活性杀菌剂的杀菌效果，为农作物防病提供更有效的保护。

继续改进研究方面，还可以从以下几个方面进行：5. 应用生物活性杀菌剂的最佳时间和条件研究：研究生物活性杀菌剂在不同发病期和气候条件下的最佳应用时间和条件，选择合适的施用时机和方式，最大限度地发挥杀菌效果。

抑菌圈实验知识点(一)抑菌圈实验什么是抑菌圈实验？抑菌圈实验是一种常用的微生物学实验方法，用于测定不同物质对细菌生长的抑制能力。

通过在寒天培养基上均匀涂敷已经培养好的细菌，并在上面滴加待测物质溶液，观察并测量细菌生长受到抑制的范围。

实验步骤1.准备培养基：将寒天粉加入蒸馏水中溶解，并煮沸消毒，冷却至约50℃时均匀分装到培养皿中。

2.培养细菌：将待测的细菌涂布在寒天培养基表面，使其均匀生长。

3.添加抑制物：在涂布好细菌的寒天培养基上滴加待测物质溶液，通常是药物或化合物。

4.孵育：将培养皿倒置放在恒温培养箱中，经过一段时间后细菌会在寒天培养基上形成菌落。

5.观察与测量：观察并测量细菌生长抑制的范围，即抑菌圈的直径。

实验结果解读•抑菌圈直径的大小可以反映待测物质对细菌的抑制能力，直径越大表示抑制能力越强。

•如果抑菌圈的直径接近或超过寒天培养基的直径，说明待测物质具有较强的杀菌或抑菌作用。

•如果没有出现抑菌圈，说明待测物质对所选细菌无抑制作用，或者浓度过低。

实验注意事项•实验操作要严格遵守无菌技术，避免细菌的外源性污染。

•涂布细菌时要均匀、细心，避免形成片状或丛状生长。

•添加待测物质时要注意均匀滴加，避免产生溢出和扩散。

•移动培养皿时要轻拿轻放，尽量不晃动，以避免菌落的移位或扩散。

•实验后要妥善处理寒天培养基和培养皿，避免细菌的传播。

应用领域抑菌圈实验广泛应用于药物研发、食品安全检测、环境污染监测等领域。

通过该实验可以初步评估化合物或药物的抗菌能力，并为后续进一步研究提供参考依据。

结语抑菌圈实验是一种简单、直观的实验方法，对于评估物质的抗菌能力有着重要的意义。

通过了解抑菌圈实验的基本原理和操作步骤，我们可以更好地理解该实验在微生物学研究中的应用和意义。

细菌抑菌圈法抑制率算法
如果平板是含菌平板，则抑菌率=(Bd-Bck)/Bd*100
如果平板式抑制物质，则抑菌率=(Bck-Bd)Bck*100
Bck是对照直径，Db是处理直径。

(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼
直径)×100%查文献看到的OD值换算抑菌率的计算公式，有个疑问，如果试验设不同浓度或者不同组合的药物，那么本身这个药物就会有这个OD值，而且之间的差别还挺大的，那么这种情况下，各组合换算出来的抑菌率还能直接拿来比较分析么？
抑菌率%=[(空白菌液吸光度值一样品菌液吸光度值)X100/空白
菌液吸光度值]%用牛津杯法测抑菌作用时怎么计算抑菌率？抑菌率=菌落直径（CK）-菌落直径（处理）/菌落直径（CK）杀菌率和抑菌率有什么不同国标规定：能杀死＞50%细菌的产品才能标称有抑菌效果；能杀死＞90%细菌的产品才能标称有杀菌效果。

杀菌率和抑菌率都是杀菌能力的指标。

50%-90%称为抑菌率，＞90%称为杀菌率。

杀菌跟抑菌的作用方式是不一样的，抑菌的意思就是抑制细菌的生长，抑菌是抑制细菌不让其继续繁殖，而杀菌是破坏细菌细胞的结构，让细菌死亡。

抑菌跟杀菌只是一字之差，可以通过字面意思来理解，一个是杀掉细菌，一个是抑制细菌的生长。