第３６卷第８期２０１６年４月生态学报ＡＣＴＡＥＣＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶｏｌ．３６，Ｎｏ．８Ａｐｒ．，２０１６基金项目：国家自然科学基金项目（４１２３０７５０）；中国科学院战略先导专项Ｂ课题（ＸＤＢ０５０１０２００）
收稿日期：２０１４?１０?２６；一一网络出版日期：２０１５?一?一
?通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅ?ｍａｉｌ：ｃｕｉｘｙ＠ｕｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．５８４６／ｓｔｘｂ２０１４１０２６２０９３
车荣晓，王芳，王艳芬，邓永翠，张静，马双，崔骁勇．土壤微生物总活性研究方法进展．生态学报，２０１６，３６（８）：一?一．
ＣｈｅＲＸ，ＷａｎｇＦ，ＷａｎｇＹＦ，ＤｅｎｇＹＣ，ＺｈａｎｇＪ，ＭａＳ，ＣｕｉＸＹ．Ａｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓ．ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１６，３６（８）：一?一．土壤微生物总活性研究方法进展
车荣晓１，２，王一芳１，王艳芬１，邓永翠３，张一静１，马一双１，崔骁勇１，?
１中国科学院大学，北京一１０００４９
２格里菲斯大学，布里斯班一４１１１
３南京师范大学，南京一２１００２３摘要：微生物总活性是指在某一时段内微生物所有生命活动的总和，它直接决定着微生物行使生理二生态功能的能力，是微生物学研究的热点，也是难点三迄今为止，还没有建立直接测定微生物总活性的方法，只能用一些相关指标来间接反映它三目前常用的指标主要包括微生物的呼吸速率二生长速率以及胞内ＲＮＡ含量等三与其它一些基质和环境相比，测定土壤中的微生物总活性更为困难三通过总结研究土壤微生物总活性常用的三种方法，在简略概括传统的土壤微生物呼吸测定法的基础上，详细介绍了放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法的原理和操作流程，整理归纳了一些重要应用案例，比较分析了不同方法的优缺点，以期为选择研究土壤微生物总活性的适宜方法提供依据三
关键词：土壤微生物；微生物总活性；土壤微生物呼吸；微生物生长活性；土壤ＲＮＡ
Ａｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓ
ＣＨＥＲｏｎｇｘｉａｏ１，２，ＷＡＮＧＦａｎｇ１，ＷＡＮＧＹａｎｆｅｎ１，ＤＥＮＧＹｏｎｇｃｕｉ３，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ１，ＭＡＳｈｕａｎｇ１，
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ（ＴＭＡ）ｉｎｓｏｉｌｓｉｓｖｉｔａｌｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｉｔｃａｎｂｅｄｅｆｉｎｅｄａｓｔｈｅｓｕｍｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｔｈｅｍｉｃｒｏｂｅｓａｔａｇｉｖｅｎｍｏｍｅｎｔ．ＡｓＴＭＡｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｍｅａｓｕｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｒｏｘｉｅｓ，ｓｕｃｈａｓｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｈｅｒｅ，ｍｅｔｈｏｄｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｓｏｉｌＴＭＡａｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄ．（１）Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｍａｙｂｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｕｓ，ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｐｒｏｘｉｅｓｏｆｓｏｉｌＴＭＡ．Ｔｈｅｍａｉｎｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｉｓｔｈａｔｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｕｓｕａｌｌｙｃａｎｎｏｔａｃｃｕｒａｔｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔａｃｔｕａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ．ＷｈｅｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇＣＯ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｒＯ２ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｔｈｅｙｉｎｄｉｃａｔｅｃａｒｂｏｎｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｒａｅｒｏｂｉｃｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（２）Ｍｉｃｒｏｂｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙｍｏｒｅａｃｔｉｖｅ．Ｔｈｕｓ，ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓａｒｅａｌｓｏｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏｉｎｄｉｃａｔｅｓｏｉｌＴＭＡ．Ａｓｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｉ．ｅ．，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ａｎｄａｃｅｔａｔｅ）ｃａｎｂｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｍｉｃｒｏｂｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ．Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ，ｔｒａｃｅｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｌｙｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓａｒｅａｄｄｅｄｔｏｓｌｕｒｒｉｅｓ（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ）ｏｒｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（Ｂ??ｔｈ?ｓｍｅｔｈｏｄｓ）．Ａｆｔｅｒａｂｒｉｅｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏｂｅｓａｒｅｋｉｌｌｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｉｒｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｒｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｔｏ网络出版时间：2015-08-24 09:59:53
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２一生一态一学一报一一一３６卷一ｍｅａｓｕｒｅｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ｗｈｉｌｅａｃｅｔａｔｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｓｕｓｅｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆｓａｐｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆｕｎｇｉ．Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｒｏｂｕｓｔｔｏｏｌｓｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｏｎｅｃｒｉｔｉｃａｌｐｒｏｂｌｅｍｉｓｔｈａｔＴＭＡｉｎｃｌｕｄｅｓｂｏｔｈｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｎｏｎ－ｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｏｎｌｙｒｅｆｌｅｃｔｔｈｅｆｏｒｍｅｒ．（３）Ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ，ｎｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｒｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｃａｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｌｉｎｋｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｉｒｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓｉｓｓｕｅｃａｎｂｅｒｅｓｏｌｖｅｄｔｈｒｏｕｇｈｕｓｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＲＮＡ．ＲＮＡｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｃｌｏｓｅｌｙｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｏｓｔｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓａｓｓｕｍｅｄａｎｉｄｅａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ，ｍＲＮＡｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｎｄｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｅｒｅａｓｒＲＮＡｉｓａｐｒｏｘｙｏｆｓｏｉｌＴＭＡ．ＡｓｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒＲＮＡ（ＳＳＵｒＲＮＡ）ａｒｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｔｏｔａｌｃｅｌｌｕｌａｒｒＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ＳＳＵｒＲＮＡｃｏｐｉｅｓｃａｎｓｅｒｖｅａｓａｎｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｓｏｉｌＴＭＡａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＳＳＵｒＲＮＡｃｏｐｉｅｓｔｏＳＳＵｒＲＮＡｇｅｎｅｃｏｐｉｅｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅａｖｅｒａｇｅｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ａｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃａｎｂｅｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄｕｓｉｎｇｐｒｏｆｉｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｕｃｈａｓｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙ，Ｔ?ＲＦＬＰ，ａｎｄｈｉｇｈ?ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡ．Ｔｈｅｓｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓｃａｎｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓａｎｄｔｈｅｉｒａｃｔｉｖｉｔｙｖｉａｉｎｓｉｔｕｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｉｓｓｔｉｌｌｎｏａｄｅｑｕａｔｅｅｖｉｄｅｎｃｅｔｏｓｕｐｐｏｒｔｔｈｅａｓｓｅｒｔｉｏｎｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡｃａｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｎｏｎ?ｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｎｏｎｅｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｐｅｒｆｅｃｔｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｏｉｌＴＭＡ；ａｎｄａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｓｓｈｏｕｌｄｂｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ；ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｏｉｌＲＮＡ
当前微生物生态学的研究正从两个方面展开：即微生物多样性和微生物功能，前者关注特定环境中的微生物群落结构，广泛采用分子生物学研究方法，并取得了显著进展；后一方面的研究深化了我们对微生物介导的特定生态过程的理解三微生物生态学研究的最终目标是建立微观尺度的微生物群落结构与宏观尺度的生态系统功能之间的联系，而微生物活性正是整合两者不可或缺的纽带三鉴于其极端重要性，微生物活性已经成为相关研究必须测定的基本指标，粗略检索发现，近些年每年都有上百篇生态二环境二土壤等方面的研究论文测定了微生物活性，但是基于研究目的和实验条件的不同，微生物活性的内涵和测定方法也有很大的差异，因此迫切需要界定微生物活性的含义，完善和开发微生物活性的测定方法三
微生物活性又称为微生物代谢活力［１］，严格意义上是指微生物在某一时段内所有生命活动的总和，或在环境介质中微生物介导的所有过程的总和三从上述定义可以看出，直接测定微生物活性近乎是不可能的三基于此，绝大部分研究用特定代谢过程的速率来反映微生物的特定活性，如跟氮素转化相关的固氮活性［２］二硝化及反硝化活性［３］，与碳转化相关的纤维素分解活性［４］等三这些研究为理解微生物在生态系统的特定功能过程中的作用提供了重要基础，但是往往不能反映环境中微生物整体的代谢状态和综合生态系统功能三另一些研究则试图寻找相关指标（ｐｒｏｘｙ），间接反映微生物的总活性［５?７］三
任何生命活动都需要能量供给，因此与能量供给相关的指标可以用来表征微生物总活性三这些指标主要包括微生物的ＡＴＰ含量二呼吸速率等三由于ＡＴＰ指征法存在较大的缺陷，现在更多采用呼吸速率反映微生物总活性［８?１０］三通常认为微生物活性与生长速率有正相关关系，即生长速率快的微生物具有更高的活性，所以微生物的生长速率也已成为表征微生物总活性的重要指标之一三早先的研究多采用平板计数或测量微生物生物量等方法测定微生物的生长速率，这些方法效率较低，已逐渐被放射性同位素标记法取代［６］三ＲＮＡ与生物体内各种酶的合成密不可分，而酶是生命活动的主要承担者，随着ＲＮＡ提取和定量方法的发展，用微生物胞内ＲＮＡ浓度来表征微生物总活性的方法逐步完善，并被推广应用［５］三
相比于其他环境介质，土壤基质具有更为复杂的组成和结构，对微生物总活性的测定有较大的干扰，测定更加困难三目前有关土壤微生物总活性的研究主要采用土壤微生物呼吸测定法二放射性同位素标记法及ＲＮＡ直接表征法进行，其中土壤微生物呼吸测定法作为研究微生物总活性的经典方法已为国内外研究者所
熟知，而放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法出现的时间相对较短，虽然在国际上已有大量的研究和应用［５?６］，但在国内尚未见该方法的研究报道三在此，我们简要概述土壤微生物呼吸测定法，详细介绍放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法在研究微生物总活性中的应用，比较各方法的优缺点，供微生物生态学二环境科学和微生物工程等领域的相关研究人员参考三
１一土壤微生物呼吸测定法
微生物呼吸是指微生物通过分解有机物质产生能量的过程，它是微生物几乎所有生命活动的能量来源三因此，呼吸作用的强弱在很大程度上可以反映微生物的总活性，而基于呼吸速率的微生物活性测定也已成为土壤微生物研究最常用的方法之一三土壤微生物呼吸速率常用的测定方式有三种：ＣＯ２释放速率二Ｏ２消耗速率和呼吸引起的温度变化，其中尤以前两种方法最为常用三为排除动二植物的影响，土壤微生物呼吸速率多在非原位状态下测定：即采集土壤样品，去除其中的植物根系后，置于一定的温度二水分等条件下培养三在此过程中ＣＯ２或Ｏ２浓度的变化一般采用气相色谱仪二红外气体分析仪（ＩＲＧＡ）二氧电极或专门的呼吸仪等仪器测定［７］，温度变化的测定则需要高精度测温装置［７］三微生物呼吸测定能较为准确地反映微生物总活性，且技术要求低，因此最早得到广泛的应用三呼吸作用是碳循环的重要环节，ＣＯ２是呼吸作用的主要产物，又是最主要的温室气体之一，随着全球变暖问题日益凸显，微生物在碳素转化中的作用愈发广受关注三测定微生物呼吸既能反映土壤微生物总活性，又能表征其在碳素转化中的生态功能，因此该方法至今仍是测定土壤微生物活性最常用的方法之一三在测定土壤微生物呼吸速率的同时，结合多种土壤酶活性的分析［１１?１３］，可以更准确地反映和理解土壤微生物总活性三微生物呼吸测定法也存在明显的缺陷三首先，ＣＯ２生成速率或Ｏ２消耗速率实际上反映的是有机碳矿化速率和有氧呼吸速率，与真实的微生物呼吸速率之间可能会有较大偏差［１４］；而测定土壤温度的变化又难以排除环境温度变化的影响，应用范围较窄三其次，要准确测定土壤微生物呼吸必须消除植物根系呼吸和土壤动物呼吸的影响，导致该方法难以实现原位测定三再次，该方法不能获得活性微生物种类的信息，不能建立微生物总活性与活性微生物种类之间的联系三
综上所述，该方法适用于土壤动二植物干扰较少，又不需要了解土壤活性微生物种类的研究三基于ＣＯ２生成速率的土壤微生物总活性测定适用于有机碳作为微生物的主要能源的土壤；基于Ｏ２消耗速率的方法则更适用于通气性良好二微生物以有氧呼吸为主的土壤；而基于温度变化的测定方法，因为需要设置无呼吸对照，则更适用于室内培养实验三
２一放射性同位素标记法
通常生长速率快的微生物也具有更高的代谢活性，因此生长速率也是表征微生物总活性的常用指标之
一三微生物大分子的合成速率与微生物的生长速率有很好的相关性，由于放射性同位素检测的灵敏度很高，在环境中只需添加痕量的放射性同位素标记的大分子前体物质，经短时间孵育后，通过测定微生物体内相应大分子物质的放射性活度，就可以反映微生物的生长速率三该类方法由于只添加痕量的前体物质，在孵育阶段对微生物的生长二代谢影响较小，因此成为测定微生物生长速率的常用方法三经过大量尝试和筛选，目前应用最多的前体物质为胸腺嘧啶核苷（ＴｄＲ）二亮氨酸（Ｌｅｕ）以及醋酸盐三在土壤微生物研究中，放射性胸腺嘧啶核苷标记法二放射性亮氨酸标记法常用于测定土壤细菌的生长速率；放射性醋酸盐标记法常用于测定真菌的生长速率（表１）三
胸腺嘧啶核苷是ＤＮＡ合成的前体之一，与微生物的分裂二增殖密切相关三早在１９７４年Ｔｈｏｍａｓ等就已使用放射性胸腺嘧啶核苷标记法测定土壤微生物的生长速率［１５］，该方法曾一度成为研究水生环境中微生物生长速率的标准方法三但近期有研究发现，很大一部分微生物并不能吸收胞外胸腺嘧啶核苷，因此该方法测定
３一８期一一一车荣晓一等：土壤微生物总活性研究方法进展一
４一生一态一学一报一一一３６卷一的结果不能准确反映微生物总活性［１６］三
表１一放射性同位素标记法测定土壤微生物活性的主要应用案例
Ｔａｂｌｅ１一Ｓｏｍｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｂａｓｅｄｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇ生态系统类型
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ参考文献
Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔｓ标记的前体物质
Ｌａｂｅｌｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ操作流程
Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｔｙｐｅｓ研究对象
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［２９］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ?Ｌｅｕ３Ｈ?ＴｄＲＢ??ｔｈ?ｓ流程［２５］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ?醋酸盐传统流程［２５］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３０］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ?醋酸传统流程［３０］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３１］
农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ?醋酸传统流程［３１］
森林Ｆｏｒｅｓｔ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３２］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３３］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３４］
湿地Ｗｅｔｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［２７］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［２７］
森林Ｆｏｒｅｓｔ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３５］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３６］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ真菌１４Ｃ?醋酸盐传统流程［３６］
荒漠Ｄｅｓｅｒｔ细菌３Ｈ?ＬｅｕＢ??ｔｈ?ｓ流程［３７］
亮氨酸是蛋白质合成的前体之一，与微生物的生长二代谢关系密切三环境中绝大多数微生物都能直接利用胞外亮氨酸［１６］，而且微生物胞内蛋白质含量要显著高于ＤＮＡ含量，所以亮氨酸标记法已有取代胸腺嘧啶核苷标记法的潜势［１７］三尽管在有些研究中两种方法得到的结果较为一致［１８?１９］，但在另外一些研究中这两种方法测得的微生物生长速率差异较大［２０?２１］三我们建议最好将两种方法结合起来进行土壤微生物总活性研究，在条件无法满足时应优先考虑使用放射性亮氨酸标记法三
醋酸盐是真菌麦角固醇合成的前体物质三尽管并不是只有真菌才能利用醋酸盐，但是麦角固醇却是真菌所特有的，是其细胞膜的重要组分三因此，可以通过分离并测定麦角固醇的放射性活度，排除其它微生物的影响三基于此，放射性醋酸盐标记法可用于测定真菌的生长速率三Ｐｅｎｎａｎｅｎ等在１９９８年首次使用这一方法研究土壤中真菌的生长速率［２２］，此后，该方法被广泛应用于此类研究中［２３?２５］三
应用放射性同位素标记法测定土壤微生物总活性的传统方法不需要分离提取土壤微生物，而是直接向用蒸馏水制备的土壤悬浊液中施入放射性标记的前体物质三此后Ｂ??ｔｈ改进了这一方法，先将土壤中的微生物使用 混匀 离心 的方法提取出来，之后再进行放射性同位素标记［２６］三流程改进后可以有效地排除同位素标记物质被土壤颗粒吸附引起的干扰［６］三现在，胸腺嘧啶核苷和亮氨酸标记法一般采用Ｂ??ｔｈ改进的流程［２７］，但由于从土壤中提取真菌的效率较低，采用醋酸盐标记法研究土壤真菌总活性时一般采用不提取真菌的传统流程三不管采用传统方法还是Ｂ??ｔｈ改进的方法，在放射性同位素标记的前体加入之前都要将待测体系置于测试温度下稳定１０分钟左右；在施入放射性同位素标记的前体后，根据实验需要选择合适的孵育时间（一般Ｌｅｕ和ＴｄＲ标记法为１ ２小时；醋酸盐标记法为４小时左右）；孵育结束后向体系中加入适量５％的福尔马林，杀死微生物并终止反应；之后选用合适的方法提取相应的大分子物质（Ｌｅｕ标记法需提取蛋白质；ＴｄＲ标记法需提取ＤＮＡ；醋酸盐标记法则需要提取麦角固醇），并溶于ＮａＯＨ溶液［２８］；最后用液体闪烁仪测定相应大分子物质的放射性活度，并结合孵育时间计算微生物的生长速率［２６］三
Ｒｏｕｓｋ等已经对放射性同位素标记法的应用案例做了较为详尽的总结［６］，我们在此不再赘述，仅对近年的研究做了一些简单补充（表１）三可以看出，该方法在农田二草地以及森林等主要陆地生态系统类型上都有
着广泛的应用三如前所述，现在土壤细菌生长速率和活性研究多采用放射性亮氨酸标记法，仅有一个研究结合了放射性亮氨酸标记法和放射性胸腺嘧啶核苷标记法［２５］三为提高同位素标记法的检测效率和灵敏度，现在细菌生长速率的测定一般采用Ｂ??ｔｈ改进的操作流程；而因为从土壤中提取真菌难度较大，真菌的相关研究多采用传统操作流程的放射性醋酸盐标记法三
应用放射性同位素标记法测定土壤微生物的生长速率和总活性有两个问题备受关注：一是该方法的测量结果能在多大程度上反映原位的状况？针对这一问题开展的研究表明，改变一些重要的环境条件，微生物仍然能够在数小时内维持其原有的生长速率不变，并且该方法的操作环节较易完成，一般对测定结果的影响很小［２６，３８?３９］，因此，其测定结果可以较为准确地反映土壤原位真实的微生物生长速率和总活性三第二个问题是，该方法能否特异性地测定土壤细菌或真菌的总体生长速率和总活性？研究发现，不管采用传统操作流程，还是采用Ｂ??ｔｈ改进的流程，ＴｄＲ或Ｌｅｕ标记法都能特异性地测定土壤细菌的生长速率和总活性［３９?４０］三由于麦角固醇是真菌所特有的，所以醋酸盐标记法测定真菌生长速率和总活性的特异性也较好三
当然，应用放射性同位素标记法测定土壤微生物总活性也存在三个无法避免的缺陷三首先，放射性同位素可能会给待测微生物造成较大损害，从而影响测定结果三其次，该方法无法给出微生物的种类组成信息，只能得到较单一的土壤微生物总体生长速率结果三第三，微生物生长速率并不完全等价于微生物活性［５］，微生物生长速率能在多大程度上表征微生物总活性也是最值得关注的问题和研究课题三事实上，微生物活性由生长活性和非生长活性两部分构成，而微生物生长速率仅能反映微生物的生长活性三已有研究发现微生物在某些胁迫条件下会提高自身的非生长活性［４１］，而且土壤中的微生物绝大部分都处于非生长状态［４２?４３］，没有生长活性，只有非生长活性三因此，直接用微生物生长速率表征微生物活性有时会产生较大偏差三
综上所述，放射性同位素标记法在测定微生物生长速率方面有较大优势，但作为微生物总活性的间接指标，由于其只能指示生长活性，存在较大的局限性三可以用于近似表征营养供应及其它环境条件良好二微生物生长活性占主导的土壤中微生物的总活性三
３一ＲＮＡ直接表征法
蛋白质是绝大多数生命活动的直接承担者，在翻译过程中，信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）是模板，转运ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）是搬运氨基酸的工具，核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）是构成翻译工厂的核心组件，它们与蛋白质合成关系极为密切，因此通过ＲＮＡ来反映微生物活性已成为一种重要的研究手段［５］三在微生物活性的研究中，ｍＲＮＡ常用于表征某一特定代谢过程的活跃程度，而ｒＲＮＡ可用于表征微生物总活性，也是本文讨论的重点三用ＲＮＡ测定土壤微生物总活性有其独有的优势：能同时获得微生物的代谢活性信息和活性微生物群落结构信息；不需要孵育过程，原位测定简单易行三因此该方法已经被广泛采用，２０１３年的评述论文报道当时已经检索到用该方法研究微生物总活性的报道１００余篇［５］三ｒＲＮＡ直接表征法测定微生物总活性有着坚实的理论基础和一定的实验依据三首先，ｒＲＮＡ是核糖体的核心组分，是蛋白质合成的催化中心，因此胞内ｒＲＮＡ的量与胞内蛋白质合成速率有着紧密的关系三其次，已有研究显示多种微生物胞内ｒＲＮＡ的含量与其生长速率二代谢活性有高度相关性［４４?４６］三再次，微生物的死亡和休眠往往伴随着ｒＲＮＡ的降解［４７?４８］，只有活性微生物中存在大量ｒＲＮＡ三早期的研究多测定ｒＲＮＡ的总量来表征微生物总活性，而现在多趋向于直接分析ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数来表征微生物总代谢活性三这是因为微生物体内ＳＳＵｒＲＮＡ（核糖体小亚基ｒＲＮＡ）与ｒＲＮＡ总量有良好的线性相关关系，而且ＳＳＵｒＲＮＡ基因是微生物研究中应用最广泛的分子标记三通常１６ＳｒＲＮＡ用于表征土壤细菌和古菌总活性；１８ＳｒＲＮＡ则用于表征土壤真菌总活性三
ＳＳＵｒＲＮＡ表征法测定微生物总活性的操作流程如下：（１）土壤样品采集；（２）土壤总ＲＮＡ和土壤总ＤＮＡ提取；（３）土壤总ＲＮＡ反转录；（４）实时荧光定量ＰＣＲ测定ＳＳＵｒＲＮＡ基因和ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数；（５）通过克隆文库二末端限制性片段长度多态性（Ｔ?ＲＦＬＰ）二高通量测序等技术确定土壤活性微生物的群落组成三其中
５一８期一一一车荣晓一等：土壤微生物总活性研究方法进展一
６一生一态一学一报一一一３６卷一样品保存二ＲＮＡ提取及活性表征方式需要特别注意三
１）样品的保存问题三相比基于ＤＮＡ的微生物生态学研究，用于ＲＮＡ研究的土壤样品的保存要求更为严格三通常要求样品在采集后即刻进行液氮速冻；在运输过程中无法实现液氮保存时，可用干冰冻存作为短期的替代选择；实验室内则要求－８０?冻存三此外，现在有很多试剂公司已推出ＲＮＡ保护液类产品，可抑制ＲＮＡ的合成和降解，实现常温下样品的短期保存三
不当的保存方法可能引起ＲＮＡ降解，甚至导致试验失败，对此我们不做深入讨论三更为严重的是保存方法不当还会造成实验假象三过高的保存温度 例如简单的冷冻保存或常温保存 并不能完全阻止微生物体内ＲＮＡ的合成与降解三而通常样品保存的条件与土壤原位环境条件差异较大，这会导致测定时样品中的ＲＮＡ实际反映的是样品保存条件下的微生物活性状态，而非采样时土壤原位条件下的微生物活性状态三常见的实验假象有１６ＳｒＲＮＡ表征的活性细菌群落比１６ＳｒＲＮＡ基因表征的总细菌群落的种间亲缘关系更近，微生物总活性在各处理间无显著差异等三
总结近期用ｒＲＮＡ直接表征法研究土壤微生物活性的报道（表２），结果显示用液氮或－８０?保存土壤样品时，活性微生物群落结构能反映试验处理间的差异，我们待发表的数据也证实增温会显著改变活性细菌的群落结构（土样为液氮保存）三在较高温度下保存土壤样品，则可能降低实验结果的可信度三例如，Ｍ?ｎｎｉｓｔ?等研究积雪在不同月份对活性微生物群落的影响［４９］，五月份采集的土壤样品保存在４?，六月份的样品在环境温度下保存，结果发现五二六月份的土壤活性细菌群落结构差异较大三虽然作者在文中提及他们所采用的土壤保存方法不会影响用ｒＲＮＡ研究土壤细菌群落结构，但是我们很难辨别这种群落差异是不是因为样品保存方式不当所造成的假象三再如Ａｎｇｅｌ等调查沿降水梯度的活性微生物群落［５０］，仅用冰盒保存土壤样品，结果发现活性微生物群落结构仅在水分含量不同的土壤间表现出差异，但有理由怀疑温度的效应可能被不当的保存方法造成的假象所掩盖三
表２一ＲＮＡ直接表征法测定土壤微生物总活性的主要应用案例
Ｔａｂｌｅ２一ＳｏｍｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｕｓｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡ
生态系统类型
Ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
Ｄａｔａｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ活性微生物群落结构
Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｔｙｐｅｓ样品保存方法
Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ数据表示方法
Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｂｅｓ微生物总活性
灌木林
未涉及［４９］Ｓｈｒｕｂｌａｎｄ常温或４?未涉及季节因素影响大
地点之间无差异
灌木林
未涉及［５０］Ｓｈｒｕｂｌａｎｄ冰盒未涉及仅在土壤含水量
不同的小区间有差异
森林Ｆｏｒｅｓｔ保护液ｇ－１土壤无差异无差异［５１］
草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ－８０?未涉及差异显著未涉及［５２］森林Ｆｏｒｅｓｔ液氮ｎｇ－１ＤＮＡ未涉及无差异［５３］森林Ｆｏｒｅｓｔ液氮ｎｇ－１ｃＤＮＡ差异显著未提及［５４］２）土壤ＲＮＡ提取问题三土壤ＲＮＡ有多种提取方法，刘华等总结了包括Ｔｒｉｚｏｌ法二ＳＤＳ?Ｐｈｅｎｏｌ法和试剂盒法在内的多种方法［５５］三对于有机质含量较高的土壤，我们建议优先选择试剂盒法；若采用常规方法则需用核酸纯化柱去除杂质三所提取ＲＮＡ的质量多用１％的琼脂糖凝胶电泳检测，理论上会出现三条较亮的电泳条带，自上到下分别对应ＬＳＵｒＲＮＡ（核糖体大亚基ｒＲＮＡ）二ＳＳＵｒＲＮＡ和５．８／５ＳｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ等则呈弥散状分布于ＬＳＵｒＲＮＡ条带下方三但实际上５／５．８ＳｒＲＮＡ条带一般不可见，故电泳图谱出现两条清晰条带即可证明ＲＮＡ提取是成功的（图１ａ）三由于在细胞内ＬＳＵｒＲＮＡ和ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数之比为１，所以条带的亮度主要由片段的长度决定三因为２８ＳｒＲＮＡ长度为１８ＳｒＲＮＡ的２．４倍左右，所以真核生物中判别ＲＮＡ提取质量的另一方法是根据两个条带的亮度，第一条亮带的亮度达到第二条亮带的两倍即为成功三但２３ＳｒＲＮＡ与１６ＳｒＲＮＡ长度比一般在１．８左右，所以原核生物ＲＮＡ两个条带的亮度差异不是特别明显三此外，若在ＳＳＵｒＲＮＡ条带上方仍有条带出现则证明所提取的ＲＮＡ中混有残留的基因组ＤＮＡ（图１ｂ），需用ＤＮＡ酶消化去除三
图１一土壤ＲＮＡ提取电泳图Ｆｉｇ．１一ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｓｏｉｌＲＮＡ一ａ：正常的土壤ＲＮＡ电泳图；ｂ：有基因组ＤＮＡ残留的土壤ＲＮＡ电泳图
３）活性表征的方式三推荐使用单位质量（一般为每克）干土中ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数表征土壤微生物总活
性，用ＳＳＵｒＲＮＡ与ＳＳＵｒＲＮＡ基因拷贝数的比值表征
微生物的平均活性三有些研究用每纳克核酸中ＳＳＵ
ｒＲＮＡ的拷贝数表征微生物总活性（表２），这种表示方法实际上反映的是土壤核酸的组成比例，与微生物活性
关系不大三采用该指标并不合理，甚至可能会掩盖试验
的处理效应，得出错误的结论三
当然，用ｒＲＮＡ直接表征土壤微生物的活性也存在
一定的风险［５］三首先，微生物胞内ＳＳＵｒＲＮＡ含量与微生物活性之间的量化关系还未完全确立，仅有的少数研
究也发现这一量化关系在不同微生物之间有较大的差异［５，５６?５８］，因此在群落和生态系统尺度上是否有确定的关系还存在疑问三其次，尚未有研究确定微生物胞内ＳＳＵｒＲＮＡ含量是否与微生物的非生长活性相关，因此ＳＳＵｒＲＮＡ能否表征微生物总活性还需要进一步的试验验证三再次，因为土壤ＲＮＡ和ＤＮＡ一般是分别提取的，采用不同的方法体系，用ＳＳＵｒＲＮＡ与ＤＮＡ的比值表征微生物平均活性会因此产生不确定性［５９］三ＳＳＵＲＮＡ表征法在指示微生物总活性方面有很强的应用潜力，在表征活性微生物群落结构方面已有较为广泛的应用［６０?６１］三但一般认为该方法在微生物处于生长稳态时的使用效果最好，如果要应用于其他条件，则需要辅以其它验证性实验，以确立ＳＳＵｒＲＮＡ拷贝数与微生物总活性的关系三
４一结论
综上所述，土壤微生物呼吸测定法二放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法是基于不同的原理来指示土壤微生物总活性的，各有长处，同时也都有明显的缺陷（表３）三土壤微生物呼吸测定法非常适用于表征微生物总活性，但该方法的主要问题在于现存测定方法并不能真实反映微生物总的呼吸强度，但在通气性良好的土壤中，微生物呼吸方式大多为有氧呼吸，可以通过Ｏ２消耗速率近似反映微生物总活性；在微生物以有机碳作为最主要的能量来源时，ＣＯ２生成速率可以较好地反映微生物总呼吸三放射性同位素标记法测定的指标为生长速率，因此它适合于表征微生物的总体生长活性，也可在有利于微生物良好生长的环境中近似表征微生物总活性三在我国，由于放射性标记物质的购买二运输二环境释放和测定等受到极大的限制，该方法的生态学应用非常困难三ＲＮＡ直接表征法相比于前两种方法有明显的优势，它既能原位测定微生物总活性，又能提供微生物种类组成信息三但是，目前在实验证据上对它能否准确地反映土壤微生物总活性还存在疑问三在方法的选择上需要根据实际情况综合考量，确定合适的方法开展土壤微生物总活性研究；在条件允许的情况下，建议将几种方法组合使用三
表３一三种土壤微生物活性研究方法的比较
Ｔａｂｌｅ３一Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ
研究方法Ｓｔｕｄｙｍｅｔｈｏｄｓ土壤微生物呼吸测定法Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ放射性同位素标记法ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｌｉｎｇＲＮＡ直接表征法ＲＮＡｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓ基本原理Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ生命活动的能量来源
生长速率蛋白质合成原位测定Ｉｎｓｉｔｕ否
否能种类组成信息Ｓｐｅｃｉｅｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ否
否能主要问题Ｍａｉｎｉｓｓｕｅｓ
已有的测定方法并不能真实反映
微生物呼吸速率只能反映生长活性与微生物活性的关系缺乏
足够的实验证据支持７一８期一一一车荣晓一等：土壤微生物总活性研究方法进展一
８一生一态一学一报一一一３６卷一致谢：我们诚挚感谢周小奇博士二ＪａｃｋｉｅＷｉｌｋｉｎｓｏｎ以及两位匿名审稿人，他们在本文的修改过程中提出了宝贵意见和建议三
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［１９］一ＲｏｕｓｋＪ，ＢｒｏｏｋｅｓＰＣ，Ｂ??ｔｈＥ．ＣｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｓｏｉｌｐＨｅｆｆｅｃｔｓｏｎｆｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｓｕｇｇｅｓｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｄｕｎｄａｎｃｙｉｎｃａｒｂｏｎｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，７５（６）：１５８９?１５９６．
［２０］一ＲａｎｎｅｋｌｅｖＳＢ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｄｒｉｖｅｎａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｐｅａｔｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｙｍｉｄｉｎｅａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７（３）：１１１６?１１２２．
［２１］一ＲｏｕｓｋＪ，Ｂ??ｔｈＥ．ＦｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｉｎｓｏｉｌｗｉｔｈｐｌａｎｔｍａｔｅｒｉａｌｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣ／Ｎｒａｔｉｏｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００７，６２（３）：２５８?２６７．
［２２］一ＰｅｎｎａｎｅｎＴ，ＦｒｉｔｚｅＨ，ＶａｎｈａｌａＰ，ＫｉｉｋｋｉｌａＯ，ＮｅｕｖｏｎｅｎＳ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｓｏｉｌａｆｔｅｒｐｒｏｌｏｎｇｅｄａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆｓｉｍｕｌａｔｅｄａｃｉｄｒａｉｎ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（６）：２１７３?２１８０．
［２３］一ＲｏｕｓｋＪ，ＢｒｏｏｋｅｓＰＣ，Ｂ??ｔｈＥ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｆｏｒｔｈｅｏｐｐｏｓｉｎｇｐＨｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｆｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｉｎｓｏｉｌ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４２（６）：９２６?９３４．
［２４］一ＢａｐｉｒｉＡ，Ｂ??ｔｈＥ，ＲｏｕｓｋＪ．Ｄｒｙｉｎｇ?ｒｅｗｅｔｔｉｎｇｃｙｃｌｅｓａｆｆｅｃｔｆｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙｉｎａｎａｒａｂｌｅｓｏｉｌ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２０１０，６０（２）：４１９?４２８．［２５］一ＢｅｎｇｔｓｏｎＰ，ＳｔｅｒｎｇｒｅｎＡＥ，ＲｏｕｓｋＪ．ＡｒｃｈａｅａｌａｂｕｎｄａｎｃｅａｃｒｏｓｓａｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｉｎａｎａｒａｂｌｅｓｏｉｌａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，７８（１６）：５９０６?５９１１．［２６］一Ｂ??ｔｈＥ．Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌｂｙｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ?ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２４（１１）：１１５７?１１６５．［２７］一ＦｏｒｄＨ，ＲｏｕｓｋＪ，ＧａｒｂｕｔｔＡ，ＪｏｎｅｓＬ，ＪｏｎｅｓＤＬ．Ｇｒａｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｃｙｃｌｉｎｇｉｎｓａｌｔｍａｒｓｈａｎｄｓａｎｄｄｕｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄｓ．ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓ，２０１３，４９（１）：８９?９８．［２８］一Ｂ??ｔｈＥ，ＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎＭ，ＳｏｄｅｒｂｅｒｇＫＨ．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆａｒａｐｉｄａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｙｍｉｄｉｎｅａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｂｙｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，３３（１１）：１５７１?１５７４．［２９］一ＲｏｕｓｋＪ，ＥｌｙａａｇｕｂｉＦＫ，ＪｏｎｅｓＤＬ，ＧｏｄｂｏｌｄＤＬ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｓｕｎｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｏｉｌｓａｌｉｎｉｔｙａｃｒｏｓｓａｎａｒｉｄａｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓａｌｉｎｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，４３（９）：１８８１?１８８７．［３０］一ＪｏｎｅｓＤＬ，ＲｏｕｓｋＪ，Ｅｄｗａｒｄｓ?ＪｏｎｅｓＧ，ＤｅＬｕｃａＴＨ，ＭｕｒｐｈｙＤＶ．Ｂｉｏｃｈａｒ?ｍｅｄｉａｔｅｄｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｏｉｌｑｕａｌｉｔｙａｎｄｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｉｎａｔｈｒｅｅｙｅａｒｆｉｅｌｄｔｒｉａｌ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，４５：１１３?１２４．［３１］一ＱｕｉｌｌｉａｍＲＳ，ＭａｒｓｄｅｎＫＡ，ＧｅｒｔｌｅｒＣ，ＲｏｕｓｋＪ，ＤｅＬｕｃａＴＨ，ＪｏｎｅｓＤＬ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｄｙｎａｍｉｃｓ，ｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｗｅｅｄｅｍｅｒｇｅｎｃｅｉｎｂｉｏｃｈａｒａｍｅｎｄｅｄｓｏｉｌａｒｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｔｉｍｅｓｉｎｃｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅ．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１２，１５８：１９２?１９９．［３２］一ＲｏｕｓｋＪ，ＦｒｅｙＳＤ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｗａｒｍｅｄｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌｓ．ＧｌｏｂａｌＣｈａｎｇｅＢｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１８（１０）：３２５２?３２５８．［３３］一ＷａｌｓｈＪＪ，ＲｏｕｓｋＪ，Ｅｄｗａｒｄｓ?ＪｏｎｅｓＧ，ＪｏｎｅｓＤＬ，ＷｉｌｌｉａｍｓＡＰ．Ｆｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｌｕｒｒｙａｎｄａｎａｅｒｏｂｉｃｄｉｇｅｓｔａｔｅｏｆｌｉｖｅｓｔｏｃｋｍａｎｕｒｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｅｐａｓｔｕｒｅｓｏｉｌｓ．ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓ，２０１２，４８（８）：８８９?８９７．［３４］一ＢｉｒｇａｎｄｅｒＪ，ＲｅｉｓｃｈｋｅＳ，ＪｏｎｅｓＤＬ，ＲｏｕｓｋＪ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ１４Ｃ?ｇｌｕｃｏｓｅｍｉｎｅｒａｌｉｓａｔｉｏｎｉｎａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｔｕｄｙ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，６５：２９４?３０３．［３５］一ＧｏｅｒａｎｓｓｏｎＨ，ＧｏｄｂｏｌｄＤＬ，ＪｏｎｅｓＤＬ，ＲｏｕｓｋＪ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｐｏｎｒｅｗｅｔｔｉｎｇｄｒｙｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌｓ：Ｉｍｐａｃｔｏｆｄｒｏｕｇｈｔ?ｌｅｇａｃｙ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，５７：４７７?４８６．［３６］一ＭｅｉｓｎｅｒＡ，Ｂ??ｔｈＥ，ＲｏｕｓｋＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｐｏｎｒｅｗｅｔｔｉｎｇｓｏｉｌｄｒｉｅｄｆｏｒｆｏｕｒｄａｙｓｏｒｏｎｅｙｅａｒ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，６６：１８８?１９２．［３７］一ｖａｎＧｅｓｔｅｌＮＣ，ＲｅｉｓｃｈｋｅＳ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｉｎａｈｏｔｄｅｓｅｒｔｓｏｉｌｗｉｔｈｌａｒｇｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，６５：１８０?１８５．［３８］一ＲｏｕｓｋＪ，ＤｅｍｏｌｉｎｇＬＡ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｓｈｏｒｔ?ｔｅｒｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｆｕｎｇｉａｎｄｂａｃｔｅｒｉａ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００９，５８（１）：７５?８５．［３９］一Ｂ??ｔｈＥ．Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｎｔｏｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２２（６）：８０３?８１０．
［４０］一ＲｏｕｓｋＪ，ＤｅｍｏｌｉｎｇＬＡ，ＢａｈｒＡ，Ｂ??ｔｈＥ．Ｅｘａｍｉｎｉｎｇｔｈｅｆｕｎｇａｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｎｉｃｈｅｏｖｅｒｌａｐｕｓｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｓｏｉｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００８，６３（３）：３５０?３５８．［４１］一ＳｃｈｉｍｅｌＪ，ＢａｌｓｅｒＴＣ，ＷａｌｌｅｎｓｔｅｉｎＭ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｒｅｓｓ?ｒｅｓｐｏｎｓｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｉｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｅｃｏｓｙｓｔｅｍｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００７，８８（６）：１３８６?１３９４．
［４２］一ＬｅｎｎｏｎＪＴ，ＪｏｎｅｓＳＥ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｅｄｂａｎｋｓ：ｔｈｅｅｃｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｄｏｒｍａｎｃｙ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，９（２）：１１９?１３０．［４３］一Ｓｔｅｎｓｔｒ?ｍＪ，ＳｖｅｎｓｓｏｎＫ，ＪｏｈａｎｓｓｏｎＭ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｃｔｉｖｅａｎｄｄｏｒｍａｎｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔａｔｅｓｉｎｓｏｉｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００１，３６（２／３）：９３?１０４．［４４］一ＳｃｈａｅｃｈｔｅｒＭ，ＭａａｌｏｅＯ，ＫｊｅｌｄｇａａｒｄＮＯ．ＤｅｐｅｎｄｅｎｃｙｏｎｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓｉｚｅａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｂａｌａｎｃｅｄｇｒｏｗｔｈｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５８，１９（３）：５９２?６０６．［４５］一ＲａｍｏｓＣ，ＭｏｌｂａｋＬ，ＭｏｌｉｎＳ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄａｔｔｈｅｓｉｎｇｌｅ?ｃｅｌｌｌｅｖｅｌｂｙｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍｅｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒａｔｅｓ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，６６（２）：８０１?８０９．［４６］一Ｐｅｒｅｚ?ＯｓｏｒｉｏＡＣ，ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎＫＳ，ＦｒａｎｋｌｉｎＭＪ．ＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｒｐｏＳａｎｄｒｈｌＲｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓａｎｄ１６ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ（ｒＲＮＡｇｅｎｅ）ｒａｔｉｏｓｗｉｔｈｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｂｉｏｆｉｌｍｓ，ｓａｍｐｌｅｄｂｙＬａｓｅｒＣａｐｔｕｒｅＭｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１９２（１２）：２９９１?３０００．［４７］一ＬａｈｔｉｎｅｎＳＪ，ＡｈｏｋｏｓｋｉＨ，ＲｅｉｎｉｋａｉｎｅｎＪＰ，ＧｕｅｉｍｏｎｄｅＭ，ＮｕｒｍｉＪ，ＯｕｗｅｈａｎｄＡＣ，ＳａｌｍｉｎｅｎＳＪ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆ１６ＳｒＲＮＡａｎｄａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｆｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｐｒｏｂｉｏｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ．ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，４６（６）：６９３?６９８．［４８］一ＳｅｇｅｖＥ，ＳｍｉｔｈＹ，Ｂｅｎ?ＹｅｈｕｄａＳ．ＲＮＡｄｙｎａｍｉｃｓｉｎａｇｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｏｒｅｓ．Ｃｅｌｌ，２０１２，１４８（１／２）：１３９?１４９．［４９］一Ｍ?ｎｎｉｓｔ?ＭＫ，ＫｕｒｈｅｌａＥ，ＴｉｉｒｏｌａＭ，Ｈ?ｇｇｂｌｏｍＭＭ．ＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｄｏｍｉｎａｔｅｔｈｅａｃｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｏｆＡｒｃｔｉｃｔｕｎｄｒａｗｉｔｈｗｉｄｅｌｙ
９一８期
一一一车荣晓一等：土壤微生物总活性研究方法进展一
０１一生一态一学一报一一一３６卷一ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｗｉｎｔｅｒ?ｔｉｍｅｓｎｏｗａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｓｏｉｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２０１３，８４（１）：４７?５９．
［５０］一ＡｎｇｅｌＲ，ＰａｓｔｅｒｎａｋＺ，ＳｏａｒｅｓＭＩＭ，ＣｏｎｒａｄＲ，ＧｉｌｌｏｒＯ．Ａｃｔｉｖｅａｎｄｔｏｔａｌｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｄｒｙｌａｎｄｓｏｉｌｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２０１３，８６（１）：１３０?１３８．
［５１］一ＹａｒｗｏｏｄＳ，ＢｒｅｗｅｒＥ，ＹａｒｗｏｏｄＲ，ＬａｊｔｈａＫ，ＭｙｒｏｌｄＤ．Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅａｃｔｉｖｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｌｉｔｔｅｒａｄｄｉｔｉｏｎａｆｔｅｒ１２ｙｅａｒｓｏｆｎｏｉｎｐｕｔｓ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，７９（４）：１３８５?１３９２．
［５２］一ＢａｒｎａｒｄＲＬ，ＯｓｂｏｒｎｅＣＡ，ＦｉｒｅｓｔｏｎｅＭＫ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｔｏｅｘｔｒｅｍｅｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｗｅｔｔｉｎｇ．ＴｈｅＩＳＭＥＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，７（１１）：２２２９?２２４１．
［５３］一ＳｃｈｉｎｄｌｂａｃｈｅｒＡ，ＲｏｄｌｅｒＡ，ＫｕｆｆｎｅｒＭ，ＫｉｔｚｌｅｒＢ，ＳｅｓｓｉｔｓｃｈＡ，Ｚｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ?ＢｏｌｔｅｎｓｔｅｒｎＳ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｗａｒｍｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｆａｔｅｍｐｅｒａｔｅｍｏｕｎｔａｉｎｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，４３（７）：１４１７?１４２５．
［５４］一ＢａｌｄｒｉａｎＰ，ＫｏｌａｒｉｋＭ，ＳｔｕｒｓｏｖａＭ，ＫｏｐｅｃｋｙＪ，ＶａｌａｓｋｏｖａＶ，ＶｅｔｒｏｖｓｋｙＴ，ＺｉｆｃａｋｏｖａＬ，ＳｎａｊｄｒＪ，ＲｉｄｌＪ，ＶｌｃｅｋＣ，ＶｏｒｉｓｋｏｖａＪ．Ａｃｔｉｖｅａｎｄｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌａｒｅｌａｒｇｅｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｔｒａｔｉｆｉｅｄｄｕｒｉｎｇｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．ＴｈｅＩＳＭＥＪｏｕｒｎａｌ，２０１２，６（２）：２４８?２５８．［５５］一刘华，申天琳，李学坤，付合才，戴九兰．土壤ＲＮＡ提取方法研究进展．应用与环境生物学报，２０１１，１７（６）：９１８?９２２．
［５６］一ＷｏｒｄｅｎＡＺ，ＢｉｎｄｅｒＢＪ．ＧｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒＲＮＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓａｎｄＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（ｍａｒｉｎｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅ?ｃｅｌｌｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｒＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００３，３９（３）：５２７?５３４．
［５７］一ＳｕｋｅｎｉｋＡ，Ｋａｐｌａｎ?ＬｅｖｙＲＮ，ＷｅｌｃｈＪＭ，ＰｏｓｔＡＦ．Ｍａｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｅａｎｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｉｎｄｏｒｍａｎｔｃｅｌｌｓ（ａｋｉｎｅｔｅｓ）ｏｆＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）．ＴｈｅＩＳＭＥＪｏｕｒｎａｌ，２０１２，６（３）：６７０?６７９．
［５８］一ＭｃＣｏｙＧＲ，ＫｅｇｅｌＪＵ，ＴｏｕｚｅｔＮ，ＦｌｅｍｉｎｇＧＴＡ，ＭｅｄｌｉｎＬＫ，ＲａｉｎｅＲ．ＡｎａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＲＮＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎＰｒｙｍｎｅｓｉｕｍｐａｒｖｕｍ，Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍｐｏｌｙｌｅｐｉｓ，ｃｆ．Ｃｈａｔｔｏｎｅｌｌａｓｐ．ａｎｄＫａｒｌｏｄｉｎｉｕｍｖｅｎｅｆｉｃｕｍｕｎｄｅｒｖａｒｙｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇａｎＲＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｆｏｒｓｐｅｃｉｅｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２０１４，８８（１）：１４０?１５９．
［５９］一ＳｅｓｓｉｔｓｃｈＡ，ＧｙａｍｆｉＳ，Ｓｔｒａｌｉｓ?ＰａｖｅｓｅＮ，ＷｅｉｌｈａｒｔｅｒＡ，ＰｆｅｉｆｅｒＵ．ＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｓｏｉｌｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｓｏｉｌｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００２，５１（２）：１７１?１７９．
［６０］一ＷｉｌｈｅｌｍＬ，ＢｅｓｅｍｅｒＫ，ＦａｓｃｈｉｎｇＣ，ＵｒｉｃｈＴ，ＳｉｎｇｅｒＧＡ，ＱｕｉｎｃｅＣ，ＢａｔｔｉｎＴＪ．Ｒａｒｅｂｕｔａｃｔｉｖｅｔａｘａｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｂｅｎｔｈｉｃｂｉｏｆｉｌｍｓｉｎｇｌａｃｉｅｒ?ｆｅｄｓｔｒｅａｍｓ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１６（８）：２５１４?２５２４．
［６１］一ＣｈａｒｖｅｔＳ，ＶｉｎｃｅｎｔＷＦ，ＬｏｖｅｊｏｙＣ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｌｉｇｈｔａｎｄｐｒｅｙａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｎＡｒｃｔｉｃｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｐｒｏｔｉｓｔｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｈｉｇｈ?ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔＤＮＡａｎｄＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２０１４，８８（３）：５５０?５６４．
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取 液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤 微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏 蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增 加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为0.38（Vance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不同，其值变化为0.20-0.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor 等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层 0-20cm土壤的K EC 为0.41，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为0.31。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（0.5mol·L-1）：取871.25g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。 由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） 0.2 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） 0.1000 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
. 土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LKSO溶液提取土壤，借用有机碳自动分析42仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换 系数（K），从而计算土壤微生物生物量碳。EC1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干 燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL）；32）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g KSO溶于1L蒸馏水中423）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量2水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分 钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完1 / 7 . 全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不※（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）熏蒸对照处理。 1.4.4 浸提过滤聚乙烯
土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法 1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存 2.测定 可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮） 要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。 以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。
土壤可溶性全氮测定 氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1 L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8 溶液混合定容至1L) 测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。） 标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L 的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加入1ml 氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A220和A275。以A（A= A220-A275）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。 硝态氮测定1 注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可采用硝态氮测定2进行测定
土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，
用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不 可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而
1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸
土壤微生物量碳氮磷测定方法 一、试剂配制 微生物量碳试剂： 1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于 300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。最后定容至1L；（需大量配制） 2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存； 3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液； 微生物量氮试剂： 4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2； 5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存） 6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L； 7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L 氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L； 8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合； 9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。 10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。此溶液最好现配现用。 11 工作曲线的制备：分别吸取0.00mL、0 .50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、 5.00mL 0.1mg/ml的硫酸铵标准液于1000mL容量瓶中,用0.5moL／L硫酸钾溶液定容至 100mL，摇匀。然后取1.5ml，按照样液的步骤进行显色和比色。 微生物量磷试剂： 12 1mol L-1 HCl溶液：用8.33 mL的浓盐酸用蒸馏水定容至100 mL。 13 碳酸氢钠浸提液[c（NaHCO3）= 0.5mol L-1，pH 8.5]：42.0g分析纯碳酸氢钠溶于800ml 蒸馏水，用1mol L-1 NaOH溶液缓慢调节pH至8.5，再用蒸馏水定容至1L。注意该浸提液放置时期过长时，因CO2释放使溶液pH升高。
土壤微生物分析方法 周丽霞 1. 土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸提取法） Jenkinson and Powlson（1976）比较了γ-射线、高压灭菌、干热灭菌、氯仿熏蒸灭菌的效果，发现氯仿熏蒸灭菌处理可杀死99％以上的土壤微生物，并且未改变土壤的理化性质，且容易从土壤中除去。因此，现在多利用氯仿熏蒸法进行土壤微生物生物量的测定。 （1）原理：土壤经氯仿熏蒸处理后土壤中的微生物被杀死，造成细胞破裂，使细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取的碳增加。用盐溶液提取出由死后的微生物体内渗透出来的有机碳，通过测定浸提液中的碳含量，可以计算土壤微生物量碳。 （2）操作步骤： ①预处理：一般不需要。如果担心土壤状况可能会影响分析结果（如土壤太 干，土壤中微生物生长不好等），可以将采集到的土壤调节其含水量达到最大持水量的60％，在25℃预培养1周。 ②氯仿熏蒸处理（在通风橱内进行）： 在低温下保存的土壤要先从冰箱中取出，待放置到室温时再进行分析。 称取20 g过2mm筛的新鲜土样置于50 ml 小烧杯中，放入真空干燥器内，并在真空干燥器内放置一装有去乙醇氯仿的小烧杯，烧杯内可放置几片防爆沸的干净小瓷片。同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液以吸收熏蒸期间释放出来的
CO2，还应放一装水的小烧杯（或在干燥器底部放一层湿滤纸）以保持湿度。用少量凡士林密封干燥器，在真空泵与干燥器之间可以加一缓冲瓶以防止氯仿爆沸或由于抽真空使干燥器内外压力变化而造成干燥器破裂等现象发生，然后用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾。关闭真空干燥器阀门，在25℃下暗处放置24小时。 熏蒸完成后，打开干燥器阀门（此时应听到空气进入的声音，否则可能熏蒸不彻底，要重新熏蒸），取出装水的小烧杯（或湿润的滤纸）、装有碱液和氯仿的烧杯（氯仿可倒回瓶中重复使用），用真空泵反复抽真空，并打开干燥器以除去土壤中残存的氯仿（止闻不到土壤中的氯仿气味）。 另称取等量土壤样品放入另一干燥器中，但不熏蒸，作为对照土壤。 ③K2SO4浸提： 熏蒸结束后，将土壤转移到100 ml振荡瓶中，加入60ml （或土水比1:4）0.5 M K2SO4溶液，中速振荡60分钟以使土壤完全振荡开，静置后用中速定量滤纸过滤。对照样品除不经氯仿熏蒸处理外，其他操作同熏蒸处理。 ④测定分析：一般采用K2Cr2O7容量法或碳分析仪（TOC）测定法。 K2Cr2O7容量法： 吸取10ml上述土壤浸提液于150ml消化管中，准确加入10ml 0.018 mol L-1 K2Cr2O7-12 mol L-1 H2SO4溶液，再加入2～3片干净小瓷片（防爆沸），混匀后在175℃煮沸10分钟，冷却后转移至150ml三角瓶中，用去离子水洗涤3～4次消化管使溶液体积约为70～80ml，加入1滴邻啡罗啉指示剂，用0.05 mol L-1 FeSO4标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝绿色，再变为棕红色即为滴定终点。
氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳 一、采样与样品预处理 土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO 2 。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。 土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。——林启美老师文件内容 二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE） 1、方法原理 土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。 浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。 2、仪器及设备 培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。 3、试剂 1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液 [?(H 2SO 4 )=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水， 同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约 20g无水K 2CO 3 ，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸?(H 2 SO 4 )=95~98% ，稀释19 倍） 2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于 去离子水中，稀释至1L。(需加热溶解) 3.重铬酸钾[c(1/6K2Cr2O7)=0.2000 mol·L-1]: 称取经130o C烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，