药物分析之西药分析——胰岛素生物检定法

（⼀）概述⽣物检定法是利⽤药物对⽣物体（整体动物、离体组织、微⽣物等）的作⽤以测定其效价或⽣物活性的⼀种⽅法。

它以药物的药理作⽤为基础、⽣物统计为⼯具，运⽤特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在⼀定条件下⽐较产⽣特定⽣物反应的剂量⽐例，来测得供试品的效价。

（⼆）⽣物检定法的应⽤范围1．药物的效价测定对⼀些采⽤理化⽅法不能测定含量或理化测定不能反映临床⽣物活性的药物可⽤⽣物检定法来控制药物质量。

中国药典收载了洋地黄、胰岛素、肝素、绒促性素、缩宫素、硫酸鱼精蛋⽩等的⽣物测定法及各种抗⽣素的微⽣物测定法。

有些天然药物、⽣物制品（包括⽣化药物）往往因结构复杂，⽽且往往⼜是由结构类似、⽐例不定的多种成份组成，很难⽤理化⽅法反映其⽣物活性；另⼀些药物，尤其是⼀些激素类药物，其结构相近，⽽⽣物活性不同；还有些药物虽可⽤理化⽅法测定含量，但含量不能完全反映效价，如天青A变⾊反应测定肝素，测定结果与抗凝⾎效价不⼀致。

因此，这些药物的质量控制都离不开⽣物检定。

2．微量⽣理活性物质的测定⼀些神经介质，激素等微量⽣理活性物质，由于其很强的⽣理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的⼲扰，很难⽤理化⽅法测定。

⽽不少活性物质的⽣物测定法由于灵敏度⾼、专⼀性强，对供试品稍作处理即可直接测定。

如⼄酰胆碱，5-羟⾊胺等活性物质的测定。

3．中药质量的控制中药成份复杂，⼤部分中药的有效成份尚未搞清，难以⽤理化⽅法加以控制，但可⽤⼀些以其疗效为基础的⽣物测定⽅法来控制其质量。

4．某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗⽣素及⽣化制剂中降压物质的限度检查等。

由于⽣物差异的存在，⽣物检定结果误差较⼤，重现性较差，需要控制的条件较多，加上测定费时，计算繁琐，所以，⽣物检定主要⽤于⽆适当理化⽅法进⾏检定的药物，补充了理化检验的不⾜。

简单介绍胰岛素的测定方法摘要：胰岛素是体内一类重要的多肽激素，同时它也是临床上治疗糖尿病的一线药物。

因此不论是在体测定胰岛素的含量，还是在复杂的药物体系中对胰岛素准确定量，意义都非常重大。

正如我们所知，为了正确评价不同剂型中的胰岛素在人体中的确切疗效和安全性，必须研究胰岛素在动物和人体内的药代动力学、吸收、分布、代谢和排泄的规律，这是解释生理学、药效学和毒理学正确合理地进行临床试验必不可少的重要资料，而对胰岛素的准确定量正是这些研究工作的基础。

另外，对于药剂本身而言，对胰岛素的准确定量，不但是质量标准的建立的基础，而且也是评价药物处方的关键。

关键词：胰岛素；生物检定；免疫学与传统药物相比，胰岛素类药物属生物技术药物，它们本身具有种属特异性、免疫原性和非预期的多向性活性等特点，这就给胰岛素类药物的分析方法提出了特殊的要求。

特别是药代动力学研究，它的前提就是建立可靠的测定方法。

好的胰岛素测定方法的主要标志是：特异性高，灵敏度高、重现性好、回收率高、线性范围宽。

如何专一地识别胰岛素又不受其它组分的干扰是检测方法建立的主要难题，另外胰岛素的给药量一般极低，更要求高灵敏度测定方法。

许多常规的药物分析方法在用于胰岛素分析时在特异性、灵敏度和精确度方面都有所欠缺。

本文扼要介绍目前用于胰岛素测定的主要方法。

1. 生物检定法生物检定法的基本原理是在体内和体外组织，或细胞对被测药物的某种特异反应，通过剂量(或浓度)效应曲线对目标生物技术药物定量分析(绝对量或比活性单位)，一般分为在体分析和离体组织（细胞）分析两种。

整体生物分析法测定过程对实验条件的要求较严格，操作程序较多，而许多活性细胞因子已建国际通用的标定国际单位的特定依赖细胞株和标准方法，利用这些系统进行研究是相对可靠的。

对于体内实验，一般需要建立动物模型，观察指标也需要建立相应的检查方法，因而耗时数周才能完成，价格昂贵又费时，而且观察终点受主观因素影响，造成灵敏度较低。

胰岛素药物关键质量控制方法在探讨胰岛素药物的关键质量控制方法之前，我们先来了解一下胰岛素的作用和治疗的目的。

胰岛素是一种重要的激素，它由胰腺产生，并在调节血糖水平中发挥着关键的作用。

胰岛素药物是一种用于治疗糖尿病的药物，这些药物可以取代人体自身无法产生足够胰岛素的情况，从而帮助控制血糖水平的升降。

在制药过程中，胰岛素药物的质量控制至关重要。

只有确保药物质量的稳定和一致性，才能保证病人能够获得有效的治疗效果。

下面我们将会分析胰岛素药物关键质量控制方法的几个方面。

1.原料药：胰岛素的制备涉及到糖类、氨基酸及其他辅料。

为了确保药物的质量，原料药的纯度和质量必须符合严格的标准。

生产厂商应该谨慎选择供应商并建立良好的合作关系，以确保原料药的稳定供应。

2.制剂工艺：胰岛素药物的制剂工艺也是质量控制中的关键环节。

药物的制备过程需要控制温度、压力、pH值等多个参数。

生产厂商应该建立标准化的生产工艺流程，并对工艺参数进行严格的监控和控制，以确保每一批胰岛素药物的质量和稳定性。

3.分析方法：为了对胰岛素药物的质量进行准确的评估，分析方法是不可或缺的。

生产厂商应该建立起一套完善的分析方法，包括对药物含量、纯度、杂质以及生物活性等指标的测定。

这些分析方法需要与国家药典或相关标准一致，并通过验证确保准确性和可重复性。

4.稳定性研究：药物的稳定性是胰岛素药物质量控制中重要的一环。

稳定性研究涉及到药物在储存和使用过程中的物理、化学和生物学变化。

通过对药物的稳定性进行定期评估，生产厂商可以确保药物在有效期内保持质量和活性。

在对胰岛素药物的关键质量控制方法进行综合评估时，我们需要考虑的因素包括但不限于：原料药质量的可靠性与稳定性、制剂工艺的严格标准化与可控性、分析方法的准确性和可重复性以及药物稳定性的持久性等。

总结而言，胰岛素药物的关键质量控制方法包括确保原料药质量的稳定与符合要求、建立标准化的制剂工艺流程、建立完善的分析方法和进行定期的稳定性研究。

药物分析考试大纲的三个要求层次：了解掌握熟练掌握考试要求：细目要点1.概述（1）药品质量控制目的与质量管理的意义（2）全面控制药品质量2.药品质量标准（1）药品质量标准（2）中国药典（3）制定药品质量标准的基本原则与依据3.常用的分析方法（1）定性方法：化学鉴别法、光谱鉴别法、色谱鉴别法（2）定量方法：滴定法、分光光度法、色谱法一、概述（一）药品质量控制的目的、质量管理的意义保证用药的安全、合理和有效常见的质量管理文件：《药品非临床研究质量管理规范》（GLP）、《药品经营质量管理规范》（GSP）、《药品生产质量管理规范》（GMP）《药品临床试验管理规范》（GCP）。

（二）全面质量控制：研制、生产、供应、临床使用静态分析综合评价、动态分析二、药品质量标准（一）药品质量标准是国家对药品质量、规格及检验方法所做的技术规定，是药品生产、供应、使用、检验和药政管理部门共同遵循的法定依据。

国内药品标准：《中国药典》（Ch.P.）、药品标准；国外药品标准：美国药典（USP）、美国国家处方集（NF）、英国药典（BP）、日本药局方（JP）、欧洲药典（Ph.Eup）和国际药典（Ph.Int）。

（掌握各自的简称）（二）《中国药典》1.历史沿革：建国之后至今共出了十版：1953、1963、1977、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015年版1963：开始分一、二两部。

2005：开始分三部，第三部收载生物制品。

2015：开始分四部。

2.基本结构和主要内容《中国药典》由一部、二部、三部、四部组成，首次将通则、药用辅料单独作为《中国药典》四部。

凡例（重点掌握一些概念和解释）凡例是为解释和使用中国药典，正确进行质量检验提供的指导原则。

关于检验方法和限度的规定检验方法：《中国药典》规定的按药典，采用其他方法的要与药典方法对比。

仲裁以《中国药典》方法为准。

关于标准品和对照品的规定标准品、对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，由国务院药品监督管理部门指定的单位制备、标定和供应。

胰岛素类产品药学研究基本技术要求的考虑摘要：目的本文根据近几年胰岛素类产品的申报情况和审评中的常见问题，结合国内外相关法规及通用技术指导原则，对胰岛素类产品药学研究的基本技术要求进行了梳理，对胰岛素类产品的药学基本技术要求和评价重点关注问题进行了讨论分析。

关键词：胰岛素类产品；药学研究；基本技术要求引言胰岛素类制剂种类多、规格复杂，是具有代表性的多剂量生物制剂，本文重点关注胰岛素类产品中药学研究基本技术要求的考虑，结合审评工作中遇到的突出问题，提出基于目前认知情况下对研究建议，旨在为生物制品中药学研究基本技术要求的提供参考。

1糖尿病1.1糖尿病糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是一种常见的以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。

据世界卫生组织的报告披露，全球共有4.15亿糖尿病患者，并有1.93亿人尚未确诊。

据统计，全世界每10秒钟就有1人死于该类疾病，每30秒就有1人因糖尿病而截肢。

因此，糖尿病已经成为全球性的严重的公共健康问题。

在我国，随着人民生活水平的普遍提高，近三十年来糖尿病的患病率呈显著增加趋势，已经成为世界上糖尿病患病人数最多的国家。

1.2糖尿病分型糖尿病分为1型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，Insulin-dependentdiabetesmellitus，IDDM）、2型糖尿病（非胰岛素依赖型糖尿病，Non-insulindependentdiabetesmellitus，NIDDM）以及特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病等。

1型糖尿病必须注射胰岛素后才可稳定病情，多发于40岁以下人群，该病与自身免疫系统缺陷以及遗传因素有关。

其临床症状多为“三多”，即多饮、多尿、多食等。

2型糖尿病多发于40岁以上的中老年人群，其发病原因主要为胰岛素抵抗以及胰岛素分泌不足合并存在，导致患者自身胰岛素处于相对缺乏的状态。

其临床症状不明显，部分患者无症状，常常难以确定其何时发病。

在1980-2004年间，全球的2型糖尿病发病率提高了两倍，这多与肥胖、久坐不动的生活方式以及人口老龄化密切相关。

本法系比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长新鲜兔血或猪、兔血浆凝结时间的程度,以测定供试品的效价。

肝素标准品溶液的配制精密称取肝素标准品适量，按标示效价加0.9％氯化钠溶液溶解使成几种不同浓度的溶液，相邻两种浓度每1ml中所含肝素单位数相差应相等,且不超过5个单位，一般可配成每1ml中含85、90、95、100、105、110、115、120、125等单位的溶液。

供试品溶液的配制供试品如为粉末，精密称取适量,按干燥品计算，加0.9％氯化钠溶液溶解使成每1ml中含1mg的溶液。

供试品如为注射液,则按标示量加0.9％氯化钠溶液稀释至同样浓度。

血浆的制备按肝素生物检定法中血浆制备法制备(附录Ⅻ D)。

检定法取管径均匀(0.8×3.8cm)清洁干燥的小试管8支,第1管和第8管为空白对照管，加入0.9％氯化钠溶液0.2ml，第2～7管为供试品管，每管均加入供试品溶液0.1ml,再每管分别加入上述一种浓度的肝素标准品稀释液0.1ml,立即混匀。

取刚抽出的兔血适量，分别加入上述8支试管内,每管 0.8ml，立即混匀，避免产生气泡,并开始计算时间，将小试管置37±0.5℃恒温水浴中,从采动物血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过2分钟；如用血浆,则分别于上述各管中加入0.7ml的血浆，置37±0.5℃恒温水浴中预热5～10分钟，每管分别加入1％氯化钙溶液0.1ml，立即混匀，避免产生气泡,并开始计算时间。

观察并记录各管凝结时间。

结果判断两支对照管的凝结时间相差不得超过1.35倍。

在供试品管的凝结时间不超过两支对照管平均凝结时间150％的各管中，以肝素浓度最高的一管作为终点管。

同样重复5次，5次试验测得终点管的肝素浓度,相差不得大于10个单位。

5次结果的平均值，即为硫酸鱼精蛋白供试品(干燥品)1mg中和肝素的单位数。

简单介绍胰岛素的测定方法摘要：胰岛素是体内一类重要的多肽激素，同时它也是临床上治疗糖尿病的一线药物。

因此不论是在体测定胰岛素的含量，还是在复杂的药物体系中对胰岛素准确定量，意义都非常重大。

正如我们所知，为了正确评价不同剂型中的胰岛素在人体中的确切疗效和安全性，必须研究胰岛素在动物和人体内的药代动力学、吸收、分布、代谢和排泄的规律，这是解释生理学、药效学和毒理学正确合理地进行临床试验必不可少的重要资料，而对胰岛素的准确定量正是这些研究工作的基础。

另外，对于药剂本身而言，对胰岛素的准确定量，不但是质量标准的建立的基础，而且也是评价药物处方的关键。

关键词：胰岛素；生物检定；免疫学与传统药物相比，胰岛素类药物属生物技术药物，它们本身具有种属特异性、免疫原性和非预期的多向性活性等特点，这就给胰岛素类药物的分析方法提出了特殊的要求。

特别是药代动力学研究，它的前提就是建立可靠的测定方法。

好的胰岛素测定方法的主要标志是：特异性高，灵敏度高、重现性好、回收率高、线性范围宽。

如何专一地识别胰岛素又不受其它组分的干扰是检测方法建立的主要难题，另外胰岛素的给药量一般极低，更要求高灵敏度测定方法。

许多常规的药物分析方法在用于胰岛素分析时在特异性、灵敏度和精确度方面都有所欠缺。

本文扼要介绍目前用于胰岛素测定的主要方法。

1. 生物检定法生物检定法的基本原理是在体内和体外组织，或细胞对被测药物的某种特异反应，通过剂量(或浓度)效应曲线对目标生物技术药物定量分析(绝对量或比活性单位)，一般分为在体分析和离体组织（细胞）分析两种。

整体生物分析法测定过程对实验条件的要求较严格，操作程序较多，而许多活性细胞因子已建国际通用的标定国际单位的特定依赖细胞株和标准方法，利用这些系统进行研究是相对可靠的。

对于体内实验，一般需要建立动物模型，观察指标也需要建立相应的检查方法，因而耗时数周才能完成，价格昂贵又费时，而且观察终点受主观因素影响，造成灵敏度较低。

表3　志愿者口服试验制剂和参比制剂后主要药代动力学参数(x ±sd)制剂t 1/2(A )/h t 1/2(B )/h T peak/h C max /L g ・ml -1AUC/L g ・m l ・h -10-240-∞F(%)T 0.843±0.294 5.329±1.895 1.5±0.2959.981±2.23433.923±5.34341.526±6.29099.132±0.069R1.060±0.3975.297±2.3942.0±0.3438.281±1.66534.332±5.59042.693±8.2252.3　试验制剂和参比制剂血药浓度-时间曲线志愿者口服试验制剂和参比制剂血药浓度均值-时间实测曲线如图2所示。

图2　18名志愿者口服试验制剂和参比制剂血浓度均值-时间实测曲线2.4　生物等效性两制剂主要药代动力学参数方差分析、单双侧t 检验和(1-2A )置信区间分析示两制剂为生物等效制剂。

如表4所示。

表4　生物等效性评价结果参数t 1t 290%可信限AU C 0-∞10.80010.60696.0-104.5AU C 0-2413.86615.31793.7-104.1t 1/2(B ) 3.169 2.52664.1-141.0C max 7.687 4.15790.5-123.3T pea k36.3067.48984.8-98.5 ≥t(1-A )∶1.74603　讨　论本实验建立了高效液相色谱法测定醋氯芬酸血药浓度的方法,该法专一性强,灵敏度高,符合生物等效性试验要求。

多因素方差分析显示,醋氯芬酸试验制剂和参比制剂单剂口服双交叉试验主要药动学参数(A U C 0-∞、A U C 0-24)无显著性差异,进一步双单侧t 检验和(1-2A )置信区间分析个体间、周期间和剂型间符合生物等效的假设,即醋氯芬酸片和市售的Beofenac 具有生物等效性。