生物药物分析与检验酶分析法共81页文档

可以用此法测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定

由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些
原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸
收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成
为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
1、利用作底物的测定法
在一定pH及温度下测定反应初速度。反应时除被测物（底 物）外，其他影响反应速度的物质均为过剩，则反应初速 度与被测物的浓度成正比关系。
张晓静 2009.09
2、利用辅酶或抑制剂作用测定
如被测物质可作为某种酶专一的辅酶（或抑制剂），则这 种物质的浓度和将其作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速 度之间有关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进行这 种物质的定量。
二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。

缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。

张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力 二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。

酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。

温度对酶反应的影响
机理：
温度导 致酶蛋 白变性
最适温度
温度对酶反应的影响
? 在最适温度之前，一般温度越高，反应速 度就越快。
? 酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力 要高。通常酶制剂以固体保存为佳。
（5）空白和对照
空白 指杂质反应和自发反应引起的变化量， 提 供未知因素的影响
对照作为比较或标定的标准。
等。 ? 因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率 ，
反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用 初速率来测定制剂中酶的含量。
检验酶反应和测定系统是否适宜的标准
?测得的反应速度必须和酶浓度间有线 性的比例关系
一、基本概念
? 4.酶反应的速度：用单位时间内反应底物 的减少或产物的增加来表示，酶反应的速 度愈快所表示的酶活力愈高。
国际酶活力单位
? 1961年,国际生物化学协会酶学委员会提 出采用统一的“国际单位”(U)来表示酶 活力，规定为：在最适反应条件(温度 25℃)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1) 底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶 活力单位，即
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?
1 U = 1 umol／min。
酶的比活力 (specific activity)
? 比活力 :每mg蛋白质所含的酶活力单位 数表示，
? 比活力 =活力 U／mg蛋白 =总活力 U/总蛋 白mg
? 有时用每 g酶制剂或每 m1酶制剂含有多 少个活力单位来表示(U／g或U／ml)。
? 比活力大小的含义： 可用来比较每单位 质量蛋白质的催化能力。比活力愈大， 表示酶的纯度愈高。
活力单位(U)与比活力
酶活不能反映酶的使用效果 只能用于产品质量的控制
测定过程中应注意的问题

品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸 的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键。其水解速率为酯键＞酰 胺键＞肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及 变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。
可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物。 目前均采用专属性较高的
例如：过氧化氢分解
2H2O2
2H2O + O2
Fe3+ 催化，效率为6×104 mol/mol. S 过氧化氢酶催化，效率为6 × 106 mol/mol.S
专一性
即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类
底物转变成相应的产物。
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酶容易变性
这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。
酶的可调节性 抑制和激活（activation and inhibition ） 反馈控制(feed back) 酶原激活(activation of proenzyme) 变构酶(allosteric enzyme) 化学修饰(chemical modification ) 多酶复合体(multienzyme complex)
（3）被测物为活化剂：当其他条件最适且一定时，活化剂在
低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在
一定范围内具有线性比例关系。但是用动力学方法测定时有
两个问题应注意：①活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制；
②对于某一种酶，相似的离子往往也能表现出活化作用，因
此测定不专一，易受到干扰。
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（4）被测物是抑制剂： 不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度，随抑制剂浓度呈
乳酸 乳酸脱氢酶 丙酮酸
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反应液（酶量，第一反应1km1,指示酶1~2个km指 ） 反应产物的抑制（反应物除去；再生系统偶联)

酶的比活力也称比活性，代表酶制剂的纯度，是指每毫克酶蛋白所具 有的活力单位数。对同一种酶来说，酶的比活力越高，纯度越高。
第一节 概述
二、酶促反应条件 选择酶反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应 该能够正常发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定 的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥作用的水平。确定反应条件时应该考虑以下因素： 1.底物 2.pH 3.温度 4.辅助因子 5.空白和对照
化学工业出版社
—适用于制药类专业
第一章 绪论 第二章 药物分析基本知识 第三章 生物药物的检查法 第四章 生物检定法 第五章 免疫分析法 第六章 电泳分析法 第七章 色谱法 第八章 酶分析法
化学工业出版社
第九章 氨基酸、肽类、蛋白质类药物的分析 第十章 抗生素类药物的分析 第十一章 维生素类药物的分析 第十二章 核酸类药物的分析 第十三章 甾体激素类药物的分析 第十四章 药物制剂及工艺用水的分析 第十五章 基因工程药物分析 第十六章 体内药物分析常用方法与应用
（8-2） 式中，V为测定时的反应速度，VMAX为最大反应速度，[S]为底物浓度。按 反应速度定义：
（8-3） 式中，t为反应时间，k为正反应的速度常数。
第一节 概述
将上式进行积分得：
（8-4）
（8-5）
式中 为初始底物浓度，在半对数坐标纸上， 与t之间呈直线关系，已知t与 ， 即可求得 ，并可计算速度常数k。 酶促反应接近完全反应所需时间为：
第一节 概述
一、基本概念
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶催化反应的速 度，可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶活力的大小，可用酶活力单位来表示。1961年国际生物化学与分 子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值诸条件均 采用最适条件），1min催化1μmol的底物转化产物的酶量定义为1个酶 活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。

1）各种氨基酸和草酸 2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA
3、辅酶变化量的测定
条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶
的底物的量，此法适用范围很广
原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大
吸收峰，而NAD和NADP在340nm无吸收带， 故可应用于NAD或NADP为辅酶脱氢酶反应 ，通过测定340nm吸光度变化，对作用相应 脱氢酶底物的物质进行定量分析
ΔA/Δt）成正比
标准曲线法
管号
标准肝素溶 液（ml）
0
标准曲线 1 2 3
4
5
样品的测定 1 2
待测样 品(ml)
0 2 1
1
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1
1
Δt1
1.0 1.0 1
1
Δt测1
1.0 1.0 1
1
Δt测2
H2O(ml) RNA(ml)
（三步） 第一步：转换反应： PG＋NAD
+
生成与待测组分相当的定量循环底物
PG脱氢酶 正比 PG 1、5-脱羧-PG＋NADH＋H+ NADH转
NADH转
可作循环底物
第二步：循环反应
PG＋NAD
1、5-脱羧-PG＋NADH＋H+ 第二步：循环反应：生成的循环底物反复参 NADH转 正比 PG NADH转 加由两个酶反应组成的偶联反应，所得产物 可作循环底物
对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH
设法除去产物
用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶
和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全 转化为反应产物
4、反应液中的酶量
对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（

GLP-1
GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素， 它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用
1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃 排空来降低血糖
2）GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用 3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲 。
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二、宿主蛋白（HCP ）残留检测
Cygnus F550 CHO HCP ELISA Kit11
宿主细胞蛋白污染物
? CHO宿主蛋白残留 ? E-coli 宿主蛋白残留 ? 酵母菌宿主蛋白残留 ? HEK293 宿主蛋白残留
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评估HCP 定量用多克隆抗体的特异性
? 2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱 ? 将2D Gel 上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育
后进行Western Blot 化学发光检测，以确认多克隆抗 体能够与哪些宿主细胞蛋白结合 ? 通过Western Blot 检测结果（多抗能检测到的 HCP数量 ）与2D膜上检测结果（总 HCP数量）的比较，得出用于 评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的 Match Rate
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试验原理
? 采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上 预包被抗 CHO CHP 多抗，免疫反应构成为夹层式 结构：固相抗体 -HCP-酶标记抗体。反应结束后 清洗酶标板去除未结合反应物，添加 TMB 底物显 色，吸光值与样品中 CHO宿主蛋白的含量成正相 关。
； 5、向孔中加入终止液，100 ul/ 孔，测定OD450nm/570nm
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数据与结果
1. 标准曲线的绘制： （1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分

接近完全地转化为产物(当有99％转化成产物 时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种 特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有 可能直接测定底物的减少量而定量待测物。
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O

UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
2. 产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物 基本上都能转变成为产物，而产物又具有可 专一性进行定量测定的物质，那么，根据产 物的增加量就能检测底物的量。
草酸的测定
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
草酸 甲酸 + CO2
瓦式呼吸计测定生成的CO2的量
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。

1. 凡例（General Notices）
把一些与标准有关的、共性的、需要 明确的问题，以及采用的计量单位、 符号与专门术语等，用条文加以规定， 以避免在全书中重复说明。
凡例是标准的一部分，同样具 有法律约束力。
2. 正文（Monographs）
是药典的主要内容，收载药品及其制 剂的质量标准。
• 举例：简介细胞因子 •
二、生物药物的质量标准
• 药品质量标准是药品生产、供应、 使用和监督管理部门共同遵循的法定 技术依据，也是药品生产和临床用药 水平的重要标准。
世界上第一本药典
• 唐朝《新修本草》 • 苏敬等人编著 • 比世界上有名的欧洲纽伦堡药典要早800余
年。
• 我国药典的全称为《中华人民共和国药典》， 其后以括号注明是哪一年版，可以简称为 《中国药典》 （2005年版），英文缩写为 CHP。
(2)溶解度是药品的一种物理性质。
2.检验方法和限度
按规定检验方法进行检验。
标准中规定的各种限度数值的规定, 系包括上限和下限两个数值本身及中 间数值。
未规定上限,指不超过101.0%
3、对比解析：标准品 对照品
(1) 标准品 指用于生物检定、抗生素或生物药品中含 量或效价测定的标准物质，以效价单位(U) 表示。
ＵＳＰ收载药物及其制剂 ＮＦ收载药用辅料，两种用途相兼 者收载于ＵＳＰ
二者合并为一册，缩写为 USP(31)NF(26)，已于2008年5月生效。
2．英国药典 British Pharmacopoeia，缩写BP， 目前为2008 年版，即BP（2008）
3．日本药局方 缩写JP，目前 为15 版，即JP（15），2002年版。
谱 分 析
谱 分

程中由于基因的融合，使得多种不同催化功能融于一条多肽链 中 2020/7/28
3-2-2 酶的分子结构与功能（2）
酶的分子组成
单纯酶（simple enzyme）
结合酶（conjugated enzyme）
蛋白质部分：酶蛋白（apoenzyme）
全酶
（holoenzyme）
小分子有机化合物
辅助因子（confactor） 金属离子
2020/7/28
3-2-2 酶的分子结构与功能（1）
酶的不同形式
单体酶（monomeric enzyme）：仅含一个多肽链 寡聚酶（oligomeric enzyme）：含二个以上的相同或不同的多
肽链（亚基） 多酶体系（multienzyme system）：由几种不同功能的酶彼此聚
合形成的多酶复合物 多功能酶（multifunctional enzyme）：一些多酶体系在进化过
3-1 酶分析法概述（6）
酶在生化分析中应用的发展趋势：
单细胞和亚细胞水平上的酶分析法
• 小型化及高选择性的分离手段：毛细管电泳和毛细管电色谱
• 高灵敏的测定方法：激光诱导荧光、安培法等
❖ 酶作为标记物的分析作用
• 广泛用于免疫分析、核酸分子杂交等领域（相关章节）
模拟酶（人工酶）分析
a. 对酶活性中心功能团的模拟：金属卟啉衍生物模拟含血红素酶 ❖ b. 酶作用方式的模拟：含咪唑、羟基、巯基等官能团的胶束 c. 抗体酶：以催化反应过渡态的类似物作为半抗原制备催化抗体
2020/7/28
3-1 酶分析法概述（1）
酶的定义：活细胞产生的，具有催化功能的特殊物质。除极个 别可催化自身反应的核酶（RNA）外，其余所有的酶都是蛋白 质。

酶免疫分析的优点与局限性
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、适用于大量样本检测等。
局限性
对某些结构相似的物质可能存在交叉反应，对某些小分子物质检测效果不佳，以及易受非特异性背景干扰等。
03 酶免疫分析技术在生物药 物分析中的应用实例
生物药物中蛋白质的分析
蛋白质的定量分析
酶免疫分析技术可以用于蛋白质的定量分析，通过标记酶和抗体结合，利用酶催化底物反应产生光信 号或电信号，实现对蛋白质的定量检测。
02
通过酶免疫分析技术，可以快 速、准确地检测生物药物中的 有效成分和杂质，为药物质量 控制提供了有力支持。
03
酶免疫分析技术的应用，还推 动了相关领域的技术创新和产 业升级，为生物医药产业的可 持续发展做出了重要贡献。
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感谢您的观看
酶免疫分析技术可以用于各 种不同类型的生物药物分析， 包括小分子和大分子药物、 蛋白质、细胞因子等。
酶免疫分析技术可以与自动 化仪器相结合，实现高通量、 自动化的药物分析，提高了 分析效率。
酶免疫分析技术的挑战
交叉反应
尽管酶免疫分析技术的特异性较高，但仍有可能出现交叉反应， 影响检测结果的准确性。
样品处理
生物样品的处理和前处理对酶免疫分析技术的结果有很大影响，需 要严格控制样品的质量和处理方法。
成本较高
酶免疫分析技术需要使用昂贵的试剂和仪器，导致分析成本较高。
酶免疫分析技术的发展前景
新技术的应用
随着新技术的发展，如纳米技术、微流 控技术等，酶免疫分析技术有望实现更 快速、更灵敏、更简便的药物分析。
蛋白质的定性分析
通过酶免疫分析技术，可以检测蛋白质的特异性抗原或抗体，从而对蛋白质进行定性分析，有助于确 定蛋白质的来源和功能。