AL蛋白酶抑制剂混合液(1mgml)

蛋白酶抑制剂选择指南1 蛋白酶抑制剂选择指南抑制剂 工作浓度 分子量 抑制蛋白酶种类 稳定性AEBSF终浓度1mM MW:239.5不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶. 可溶于水,其pH7的水溶液在4o C可保持稳定1-2个月,在pH>8的情况下会发生缓慢水解Aprotinins 抑肽酶终浓度2ug/ ml MW:6512 可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和Factor Xa。

非常稳定,当pH>12.8时失去活性,可溶于水(10mg/ml),-20o C下可长期保存Bestatin终浓度10uM MW:308.4 可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂, 工作液可保存一天,1mM的甲醇贮存液在-20o C可保存至少一个月E-64 Protease Inhibitor终浓度10uM MW:357.4 不可逆的半胱氨酸酸蛋白酶抑制剂,抑制半胱氨酸酸蛋白酶而不会影响其他酶的半胱氨酸残基,与小分子量的巯基醇如beta-巯基乙醇不会产生反应,具有高度特异性。

工作液在正常pH值下可保持稳定数天,1mM的水溶液在-20o C可保存几个月EDTA, 4Na终浓度10mM MW:380.2 金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金属依赖性生物过程。

其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5的0.5M 水溶液)在4o C可保存数月Leupeptin, 半硫酸盐 亮抑酶肽（亮肽素） 终浓度100uM MW:493.6 可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C内切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B及胰蛋白酶。

工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM水溶液)在4o C时稳定期为一周,-20o C时稳定期为一个月Pepstatin A 终浓度1uM MW:685.9 可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白酶,Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)及以1mg/ml溶于甲醇,搅拌过夜可以1mg/ml溶于乙醇,333mg/ml溶于6N的蛋白酶抑制剂选择指南2抑肽素A 很多细菌来源的天冬氨酸蛋白酶,与蛋白酶有微弱的结合。

蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

常用抑制剂PMSF PMSF即Phenylmethanesulfonyl fluoride，中文名为苯甲基磺酰氟。

分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19，纯度>99%。

常用生化试剂，用于抑制蛋白酶.【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成 1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。

如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。

【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF在水溶液中不稳定。

应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

蛋白水解酶抑制剂啊实验室常用的啊主要用于组织匀浆时用!!1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml溶于异丙醇中;3)在室温下可保存一年;4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

奥默生物电话：021-5096 7598 邮箱：techsupport@ 网站：产品简介：本产品是由6种独立的蛋白酶抑制剂（不含EDTA）按照优化的配比配置而成的蛋白酶抑制剂混合物。

其作用的靶点分别为丝氨酸蛋白酶，丝氨酸半胱氨酸蛋白酶，氨肽酶，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等，广泛作用于各种蛋白酶，可称之为广谱蛋白酶抑制剂。

本产品应于-20℃环境下密封保存，产品有效期为2年。

使用时可短时间放置于常温或4℃中，用毕应立即放回-20℃中保存。

储存条件：蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA，100X DMSO储液)蛋白酶抑制剂Cocktail 使用说明书蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶的活性，减少蛋白酶对蛋白的分解，从而有效地提高蛋白质得出率，而且不使细胞及组织本身的性质发生改变。

作用原理：产品组成：成分MTT法CCK法 AEBSFAprotininBestatinE-64LeupeptinPepstatin A Cysteine proteases Serine proteases Aminopeptidases Serine proteases Serine and cysteine proteases Aspartic proteases Irreversible Reversible Reversible ReversibleReversible Irreversible 靶点靶点类型运输条件： 蓝冰运输。

奥默生物使用说明：1. 本产品适用于哺乳动物细胞及组织的蛋白质提取及纯化，蛋白免疫印迹（WesternBlot）,免疫共沉淀（Co-IP），免疫荧光（IF），免疫组织化学（IHC），激酶测定（kinaseassay）和抗体，酶诊断试剂盒（Dignose Kit）等。

2. 实验时，按照1:100的容积比，将Cocktail预先加入在已准备好的实验体系中，轻轻混合均匀。

注意事项：1. 本产品不含EDTA，为100×DMSO储存液形式。

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。

4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。

分子量：685.9使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。

EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月分子量：372.24使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。

蛋白酶抑制剂成分蛋白酶抑制剂是一种可以抑制蛋白酶活性的化合物。

蛋白酶是一种酶类，它在细胞内起着非常重要的作用，可以分解蛋白质分子，使其成为更小的分子。

但是，在某些情况下，过多的蛋白酶活性会导致细胞内的蛋白质被分解得过快，从而对细胞造成伤害。

因此，蛋白酶抑制剂成分可以在一定程度上保护细胞免受蛋白酶的伤害。

目前，已经发现了很多种蛋白酶抑制剂成分，其中一些已经被广泛应用于医学和生物学领域。

以下是一些常见的蛋白酶抑制剂成分：1. 蛋白酶抑制剂-1（Protease Inhibitor-1）蛋白酶抑制剂-1是一种天然存在于人体中的蛋白质，它可以抑制多种蛋白酶的活性。

研究表明，蛋白酶抑制剂-1可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、肿瘤、炎症等。

2. 甲基硫代咪唑（Methylthioadenosine）甲基硫代咪唑是一种天然存在于人体中的化合物，它可以抑制多种蛋白酶的活性。

研究表明，甲基硫代咪唑可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、炎症等。

3. 金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂（Staphylococcus aureus Protease Inhibitor）金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂是一种可以抑制金黄色葡萄球菌产生的多种蛋白酶的化合物。

这种化合物可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染等疾病。

4. 蛋白酶抑制剂A（Protease Inhibitor A）蛋白酶抑制剂A是一种可以抑制多种蛋白酶活性的化合物。

研究表明，蛋白酶抑制剂A可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、心血管疾病等。

5. 磷酸二酯酶抑制剂（Phosphodiesterase Inhibitor）磷酸二酯酶抑制剂是一种可以抑制多种磷酸二酯酶活性的化合物。

研究表明，磷酸二酯酶抑制剂可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、哮喘等。

总之，蛋白酶抑制剂成分具有广泛的应用前景，在医学和生物学领域都有着重要的作用。

未来，随着科学技术的不断发展，相信会有更多的蛋白酶抑制剂成分被发现，并用于治疗更多的疾病。

蛋白酶及其抑制剂
一、蛋白酶－抑制剂对照表
二、蛋白酶抑制剂混合物选择表
三、抑制剂－蛋白酶对照表
想要寻找适合您的蛋白酶抑制剂？请参看以下蛋白酶－抑制剂对照表！
为了您实验方便，我们向您提供以下蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物表一、蛋白酶抑制剂混合物
表二、蛋白酶抑制剂（按蛋白酶抑制剂名称英文字母排序）：
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当前位置：生物帮> 实验技巧> 生物化学技术> 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要：破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

常用抑制剂PMSF1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml溶于异丙醇中；3）在室温下可保存一年；4）工作浓度:17~174ug/ml（0.1~1.0mmol/L）;5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

EDTA1）抑制金属蛋白水解酶；2) 0.5mol/L 水溶液，pH8~9;3) 溶液在4 C稳定六个月以上；4) 工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);5) 加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。

胃蛋白酶抑制剂(pepst anti n)1) 抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶;2) 1mg/ml溶于甲醇中；3｝储存液在4C 一周内稳定，-20 C稳定6个月；4) 1 作浓度:0.7ug/ml(1umol/L)5) 在水中不溶解。

常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。

蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。

对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。

蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。

溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B 溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。

pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明在与蛋白相关的检测中，最关键的一步便是蛋白质的提取。

在提取的过程中，我们要经常加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的。

本文详细总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF、Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycerophosphate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。

一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

全蛋白提取组织裂解液配方Western-Blot 全蛋白提取组织裂解液配方1.储备液10% Triton X-100Triton X-100 10ml蒸馏水90ml混合后37℃-40℃水浴中2-3hr，使其充分混匀10% 去氧胆酸纳去氧胆酸纳1g蒸馏水10ml避光保存200mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氯)PMSF 174.2mg异丙醇5ml分装，-20℃保存100mmol/L EDTAEDTA 372.24mg蒸馏水10ml1mg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)亮抑酶肽2mg蒸馏水2ml分装，-20℃保存1mg/mL 抑蛋白酶肽(Aprotinin)抑蛋白酶肽2mg蒸馏水2ml分装，-20℃保存1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)胃蛋白酶抑制剂2mg甲醇2ml分装，-20℃保存2.工作液Tris-base (50mmol/L，pH 7.4)：Tris-base 605mgNaCl 900mg蒸馏水75ml用HCl调整pH值为7.410% Triton X-100 10mL10% 去氧胆酸纳 2.5mL100mmol/L EDTA 1mL用前加入：1mg/mL亮抑酶肽100μl1mg/mL 抑蛋白酶肽100μl1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂100μl 200mmol/L PMSF 500μl各成分的终浓度Tris-base 50mmol/L，pH 7.4 Triton X-100 1%去氧胆酸纳0.25%NaCl 150mmol/LEDTA 1 mmol/L亮抑酶肽1μg/mL抑蛋白酶肽1μg/mL胃蛋白酶抑制剂1μg/mLPMSF 1mmol/L。

免疫共沉淀技术路线免疫共沉淀技术当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质—蛋白质间的结合被保持下来，因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质—蛋白质相互作用。

如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测；如果实验目的是发现新的结合蛋白，可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。

其实验步骤如下。

(1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。

刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

(2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4~C以最大速度离心15min。

(3)收集上清液(约30mi)并加入30ug的适当抗体，4~C摇动免疫沉淀物1h。

(4)加入0．9ml的蛋白质A—Sepharose悬液，4~C摇动免疫沉淀物30min。

(5)用含900mmol／LNaCl的NETN洗蛋白A—Sepharose混合物，再重复洗5次。

最后，用NETN洗1次。

(6)吸出混合物的液体部分。

加入800／Jl的1XSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。

(7)将样品加入到大孔的不连续SDS—PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。

(8)如果实验目的是发现新的结合蛋白，通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

对于实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测。

(9)如果实验目的是发现新的结合蛋白，从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1m1 50％乙腈洗两次，每次3min。

(10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

通过窄孔高效液相色谱分离肽。

将收集的肽在ABl 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

添加蛋白酶抑制剂是大多数细胞裂解和蛋白质提取的必要步骤。

蛋白质提取过程中，内源性蛋白酶会降解蛋白质，导致蛋白质产量的降低。

在裂解试剂中加入蛋白酶抑制剂，可防止提取蛋白的降解，确保在细胞裂解后获得蛋白质的产量。

蛋白酶抑制剂是生物或化学化合物，其作用是可逆或不可逆地结合蛋白酶。

大多数已知的蛋白酶属于四个进化上不同的酶家族之一，基于功能基团参与肽键的裂解。

一般情况下，蛋白提取过程中总是需要使用蛋白酶抑制剂。

大多数情况下，需使用几种不同抑制剂化合物的混合物（也称Cocktail,鸡尾酒），以确保蛋白质提取物在分析之前不会降解。

常见蛋白酶抑制剂
常见蛋白酶抑制剂活性组分
不可
常用蛋白酶抑制剂混合物组成
*EDTA影响蛋白活性时，需实验是否需要添加EDTA。

蛋白酶抑制剂PMSF配制
PMSF即Phenylmethanesulfonyl fluoride，中文名为苯甲基磺酰氟。

分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19，纯度>99%。

:
1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；
2） 10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；
3）在室温可保存一年；
4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~）；
5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

（见水分解，使用前加入）
(来自：汪家政蛋白质技术手册)
例:100mM PMSF
称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 异丙醇,震荡混匀，保存在-20度或４度.
工作浓度我一般用1mM ,1:100(V/V)加入即可.样品处理超过1h,补加一次.
(PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作．PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

）
PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

之阳早格格创做目前位子：死物助 > 真验本领 > 死物化教技能 > 正文蛋黑酶及蛋黑酶压造剂大齐日期：2012-06-13 根源：互联网标签：相闭博题：剖析蛋黑酶活性测定散焦蛋黑酶钻研新发达纲要: 破碎细胞提与蛋黑量的共时可释搁出蛋黑酶，那些蛋黑酶需要赶快的被压造以脆持蛋黑量没有被落解.正在蛋黑量提与历程中，需要加进蛋黑酶压造剂以预防蛋黑火解.以下枚举了5种时常使用的蛋黑酶压造剂战他们各自的效率个性，果为百般蛋黑酶对于分歧蛋黑量的敏感性各没有相共，果此需要安排百般蛋黑酶的浓度恩必好死物新一轮2-5合死物试剂大促销！Ibidi细胞灌流培植系统-模拟血管血液震动状态下的细胞培植系统广州赛诚死物基果表黑调控博题蛋黑酶压造剂破碎细胞提与蛋黑量的共时可释搁出蛋黑酶，那些蛋黑酶需要赶快的被压造以脆持蛋黑量没有被落解.正在蛋黑量提与历程中，需要加进蛋黑酶压造剂以预防蛋黑火解.以下枚举了5种时常使用的蛋黑酶压造剂战他们各自的效率个性，果为百般蛋黑酶对于分歧蛋黑量的敏感性各没有相共，果此需要安排百般蛋黑酶的浓度.由于蛋黑酶压造剂正在液体中的溶解度极矮，更加应注意正在慢冲液中加人蛋黑酶压造剂时应充分混匀以缩小蛋黑酶压造剂的重淀.正在宝灵曼公司的目录上可查到更完备的蛋黑酶战蛋黑酶压造剂表.时常使用压造剂PMSF1)压造丝氨酸蛋黑酶(如胰凝乳蛋黑酶，胰蛋黑酶，凝血酶)战巯基蛋黑酶(如木瓜蛋黑酶);2)10mg/ml溶于同丙醇中;3)正在室温下可保存一年;4)处事浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);5)正在火液体溶液中没有宁静，必须正在每一分散战杂化步调中加进新陈的PMSF.EDTA1)压造金属蛋黑火解酶;2)0.5mol/L火溶液，pH8~9;3)溶液正在4℃宁静六个月以上;4)处事浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);5)加进NaOH安排溶液的pH值，可则EDTA没有溶解.胃蛋黑酶压造剂(pepstantin)l)压造酸性蛋黑酶如胃蛋黑酶，血管紧弛肽本酶，构造蛋黑酶D战凝乳酶;2)1mg/ml溶于甲醇中;3}储躲液正在4℃一周内宁静，-20℃宁静6个月;4)1做浓度:0.7ug/ml(1umol/L)5)正在火中没有溶解.明抑蛋黑酶肽(leupeptin)1)压造丝氨酸战巯基蛋黑酶，如木瓜蛋黑酶，血浆酶战构造蛋黑酶B;2)lOmg/ml溶于火;3)储躲液4℃宁静一周，-20℃宁静6个月;4)处事浓度0.5mg/ml.胰蛋黑酶压造剂(aprotinin)1)压造丝氨酸蛋黑酶，如血浆酶，血管舒慢素，胰蛋黑酶战胰凝乳蛋黑酶;2)lOmg/ml溶于火，pH7~83}储躲液4℃宁静一周，-20℃宁静6个月;4)处事浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L);5)预防反复冻融:6)正在pH>12.8时得活.蛋黑酶压造剂混同使用35ug/ml PMSF…………………………………丝氨酸蛋黑酶压造剂0.3mg/ml EDTA…………………………………金属蛋黑酶压造剂0.7ug/ml胃蛋黑酶压造剂(Pepstatin)…………酸性蛋黑酶压造剂0.5ug/ml明抑蛋黑肽酶(Leupeptin)……………广谱蛋黑酶压造剂时常使用蛋黑酶压造剂表做家：青岚面打：次根源于-死物秀知讲尾页真验真验核心时常使用蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)战磷酸酶压造剂的贮存与处事液浓度时常使用蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)战磷酸酶压造剂的贮存与处事液浓度2014-06-09 23:01:02 根源：欣赏次数：119 网友评论 0 条[时常使用蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)战磷酸酶压造剂的贮存与处事液浓度] 正在与蛋黑相闭的检测中，最先最闭键的一步即是蛋黑量的提与.蛋黑量的提与历程中，咱们要时常加战蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)以预防蛋黑量的落解.其余正在磷酸化蛋黑的钻研历程中，磷酸酶压造剂也是必没有成少的，本文归纳了时常使用的蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)PMSF，Leupeptin 明肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋黑酶压造剂(proteas [蛋黑酶压造剂分子量溶解性磷酸酶压造剂处事浓度贮存液胰蛋黑酶丝氨酸]正在与蛋黑相闭的检测中，最先最闭键的一步即是蛋黑量的提与.蛋黑量的提与历程中，咱们要时常加战蛋黑酶压造剂(p rotease inhibitor)以预防蛋黑量的落解.其余正在磷酸化蛋黑的钻研历程中，磷酸酶压造剂也是必没有成少的，本文归纳了时常使用的蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)PMSF，Leupe ptin 明肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋黑酶压造剂(pr otease inhibitor)，EDTA-Na2等以及磷酸酶压造剂NaF氟化钠，Na3VO4 本矾酸钠，BETA-glycerophosphate苦油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等.对于那些蛋黑酶压造剂(protease inhibi tor)的溶解配造，贮存液与处事液浓度，保存皆搞了仔细的证明.蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)PMSF：个性：丝氨酸蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)，如胰凝乳蛋黑酶，胰蛋黑酶战凝血酶，也压造半胱氨酸蛋黑酶如木瓜蛋黑酶（可顺的大天处理）.使用：贮存浓度：200mM，处事浓度：1mMLeupeptin 明肽素个性：压造丝氨酸战半胱氨酸蛋黑酶如胰蛋黑酶，木瓜蛋黑酶，纤溶酶，战构造蛋黑酶B溶解性：下度溶于火（1mg/ml）.4℃一周宁静,分成小份热冻正在-20℃起码6个月使用：贮存浓度：1mg/ml，处事浓度0.5 ug/ml (1mM) Aprotinin抑肽酶个性：丝氨酸蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)，压造纤维蛋黑溶酶，激肽释搁酶，胰蛋黑酶，糜蛋黑酶的下活性.没有压造凝血酶或者果子X.溶解性：易溶于火（10mg/ml）或者慢冲液（比方，tris，0. 1M，pH8.0）.pH约7-8的溶液正在4℃可保存1周，分拆保存正在-20℃可起码保存6个月.预防反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活.分子量：6,512使用：贮存浓度:1mg/ml, 处事浓度：0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)Pepstatin胃蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)个性：压造天冬氨酸（酸）蛋黑酶如胃蛋黑酶，肾素，构造蛋黑酶D，凝乳酶，许多微死物酸性蛋黑酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；正在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml.4℃宁静一周，分拆储躲于-20℃时可保存1个月使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 μg/ml(1 μM) EDTA-Na2个性：金属蛋黑酶压造剂(protease inhibitor)使用：处事浓度：0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM)，没有需现用现配，正在溶液pH值调至8-9时再加进.磷酸酶压造剂NaF氟化钠溶解性：溶于火使用：贮存液：5M 处事浓度：10-20mMNa3VO4 本矾酸钠溶解性：溶于火，咱们买买过去的是本矾酸钠.本矾酸钠需要通过处理以去才搞成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具备压造去磷酸化的效率.本矾酸钠形成激活的矾酸钠的历程是: 100mM本矾酸钠激活储躲液配造(1).与0.183克的本矾酸钠溶解于10ml的单蒸火中,加酸安排PH至10(颜色变黄)(2).煮至无色(3).室温热却(4).重调PH至10(5)重复（１）（２）（３）（４）曲至溶液脆持无色，而且ＰＨ宁静于10,分拆100ul/管,每10ml裂解液加一管.(末浓度为1 mM),-20度保存.使用：贮存液：100mM 处事浓度：1mMBETA-glycerophosphate 苦油磷酸钠溶解性：溶于火使用：贮存液：100mM 处事浓度：25mMNa2P2O4 焦磷酸钠溶解性：溶于火贮存液：100mM, 处事浓度：1-2 mM闭键词汇：蛋黑酶压造剂分子量溶解性磷酸酶压造剂处事浓度贮存液胰蛋黑酶丝氨酸。