不同供氧水平对L_精氨酸分批发酵过程的影响

产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究辅酶Q10(CoQ10)作为细胞有氧呼吸链中的一个重要递氢体,广泛应用于医药和食品行业。

近年来,CoQ1o作为一种辅助药物,在治疗心脏衰竭方面,使用比例逐年增加,因此对CoQ1o的需求也不断增长。

对产CoQ1o微生物的开发利用也愈发重要。

本文以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌,研究了该菌的诱变选育、培养基优化和补料分批发酵工艺。

1.对比皂化法、超声波破碎法、反复冻融法、酸热法和酸热辅助超声法对CoQ1o提取效果的影响,确定了酸热辅助超声破胞方法的可行性。

并通过单因素实验、正交法实验确定其最佳提取工艺条件。

酸热辅助超声法提取类球红细菌中CoQ1o最优的提取条件是加入300μL的盐酸、80 ℃、400w超声处理20min。

此时,CoQ1o得率为3.738mg/g。

2.以自然筛选获得的R.spl-11为出发菌株,经过紫外-LiCl、NTG结合VK3、NaN3和PHB 复合抗性诱变,获得一株遗传性状良好的CoQ1o高产菌株,其产量为71.23mg/L,比出发菌株提高了132.17%。

通过单因素实验对R.sp3-7菌株发酵条件进行优化,得到最优条件为：32℃、初始pH为7.0、接种量8%及装液量为40mL/250mL, CoQ10产量为82.70mg/L。

3.对R.sp3-7生产CoQ1o的发酵培养基进行优化,首先通过单因素筛选确定了培养基最佳碳源、氮源和需添加的金属离子。

通过Plackett-Burman设计对培养基中的9种成分进行筛选,获得影响发酵的3个重要成分：葡萄糖、玉米浆干粉和硫酸镁,再采用Box-Behnken响应面试验对上述三种成分进行优化,获得最佳浓度：葡萄糖36.9g/L、玉米浆干粉5.3g/L、MgSO4 14.4g/L。

优化后CoQ1o产量达到135.20mg/L,比优化前提高了68.62%。

4.在5L发酵罐中考察了pH、溶氧(DO)水平对CoQ1o合成的影响,结果发现CoQ1o合成的最适pH为6.8。

发酵工艺控制——氧对发酵的影响及控制在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。

通气效率的改进可减少空气的使用量，从而减少泡沫的形成和杂菌污染的机会。

一、溶解氧对发酵的影响溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。

由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度亦如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。

溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。

如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。

需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。

溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。

因为，为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。

最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的。

根据发酵需氧要求不同可分为三类：第一类有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第二类，包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；第三类，有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。

氨基酸合成的需氧程度产生上述差别的原因，是由它们的生物合成途径不同所引起的，不同的代谢途径产生不同数量的NAD(P)H，当然再氧化所需要的溶氧量也不同。

第一类氨基酸是经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成的，产生的NADH量最多。

因此NADH氧化再生的需氧量为最多，供氧愈多，合成氨基酸当然亦愈顺利。

第二类的合成途径是产生NADH的乙醛酸循环或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统，产生的NADH量不多，因而与供氧量关系不明显。

代谢工程之利用谷氨酸棒状杆菌来生产L-精氨酸精氨酸是一种为不同工业和医疗产品所应用的重要的氨基酸。

这里我们报道了代谢工程中利用谷氨酸棒状杆菌来生产精氨酸的改进方法。

首先进行的是随机诱变，来增加谷氨酸棒状杆菌对精氨酸类似物的耐受性。

接下来进行是系统性的代谢工程来进一步对菌株进行改良。

涉及精氨酸操纵子调控阻遏物的去除，NADPH水平的最优化，破坏L-谷氨酸的生成来增加精氨酸的前体物质还有限制精氨酸合成反应的通量优化。

最终菌株的流加培养发酵在5L和大规模1500L的生物反应器中进行，分别允许生产92.5g/L和81.2g/L的精氨酸，产量为每g 碳源（葡萄糖加蔗糖）可分别产出0.40g和0.35g精氨酸。

这里描述的系统代谢工程结构对于构建棒状杆菌菌株来进行精氨酸及相关产品的工业生产是有用的。

L-精氨酸是一种工业中重要的半必需氨基酸，它在食品和补加健康食品、制药以及化妆品中有很多应用。

与其他的氨基酸和有价值的化学物质相比，利用谷氨酸棒状杆菌作为精氨酸生产工程菌有很大优势，因为它带有强烈的面向L-谷氨酸形成的通量。

跟大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌不含有argA和argE基因，但取而代之，它含有可以编码乙酰转移酶的argJ基因，可以催化两种不同的精氨酸生物合成途径的生化反应。

重要的是，谷氨酸棒状杆菌缺乏精氨酸降解酶以及在大肠杆菌中发现的精氨酸脱氨酶，因此，细胞内生产的精氨酸不能被积极地降解。

可被谷氨酸棒状杆菌利用的碳源范围也相对广阔，包括己糖和戊糖两种。

对于精氨酸的过度生产来说，调节子对精氨酸生物合成操纵子的抑制以及精氨酸对乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制在谷氨酸棒状杆菌中被显著地移除了。

在这次研究中，我们针对谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831菌株进行代谢工程研究，最初经过随机诱变来增强精氨酸的产量。

逐步地合理地代谢工程建立在针对通过菌株工程步骤实现的精氨酸产量逐步增加的代谢结果的分析的基础上。

由本次研究建立的最终菌株的流加培养获得了有效的精氨酸产量，使用5L和大规模1500L生物反应器使浓度分别达到92.5和81.2g/L。

影响发酵过程的因素影响发酵过程的因素主要有以下几个方面。

温度温度对微生物的影响是多方面的。

首先，温度影响酶的活性。

在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。

当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。

温度也能影响生物合成的途径。

例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。

此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。

因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。

但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。

如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生素的最适温度是28 ℃。

通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。

pHpH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。

细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。

此外，pH 还会影响培养基中营养物质的分解等。

因此，应控制发酵液的pH。

但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同，需要分别加以控制。

在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然会发生变化。

如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4浓度就会上升，pH也随之上升。

在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH。

目前，国内已研制出检测发酵过程的pH电极，用于连续测定和记录pH 变化，并由pH控制器调节酸、碱的加入量。

溶解氧氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。

从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6mol的氧；当糖用于合成代谢产物时，1 mol葡萄糖约需1.9mol的氧。

因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。

不同环境条件下酵母菌发酵产物变化分析酵母菌是一种微生物，可以通过发酵过程将碳源转化为有用的产物。

不同环境条件对酵母菌的发酵产物有着显著的影响。

本文将对不同环境条件下酵母菌发酵产物的变化进行分析。

一、pH值对酵母菌发酵产物的影响pH值是指溶液的酸性或碱性程度。

酵母菌的酵母发酵对pH值非常敏感。

在不同的pH值下，酵母菌的代谢过程和产物生成会发生明显的变化。

1. 低pH值条件下：当pH值低于酵母菌的最适生长范围时，发酵活性会受到压抑，导致产物生成量下降。

例如，当pH值降低至3至4之间时，乙醇和二氧化碳的产量会减少，而酸的产量会增加。

2. 中性pH值条件下：在pH值在酵母菌的最适生长范围（pH 4-6）内，酵母菌的发酵能力和产物生成量最佳。

乙醇是典型的酵母发酵产物，其在中性pH条件下的产量最高。

3. 高pH值条件下：当pH值超过酵母菌最适生长范围时，发酵活性会减弱。

在碱性条件下，酵母菌的代谢途径发生改变，导致发酵产物的种类和量发生变化。

乙醇的产量会下降，而氨和氢氧化钠等碱性物质的生成量会增加。

二、温度对酵母菌发酵产物的影响温度是另一个关键因素，能够直接影响酵母菌的生长速率和代谢过程，从而对发酵产物的生成产生影响。

1. 低温条件下：在低于酵母菌最适生长温度的条件下，酵母菌的发酵能力会降低。

例如，在低温条件下，酵母菌的生长速率减慢，乙醇和二氧化碳的产量减少。

2. 适宜温度条件下：在适宜的温度范围内，酵母菌的生长速率最快，代谢活性最高，因此产物的生成量也最大。

一般情况下，适宜的温度范围为20℃至30℃之间。

3. 高温条件下：过高的温度可能导致酵母菌的生长能力降低，甚至会导致酵母菌死亡。

在高温条件下，酵母菌的代谢途径会发生改变，产物的种类和量也会发生变化。

乙酸和乙醇的产量增加，而二氧化碳的产量减少。

三、氧气浓度对酵母菌发酵产物的影响氧气是酵母菌发酵过程中必需的底物之一，它对代谢过程和产物生成起着重要作用。

1. 低氧条件下：在缺氧条件下，酵母菌的能力产生酵母发酵产物会受到影响。

Research Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 48(8)：1056~1060; 4 August 2008基金项目: 国家高技术研究发展计划—— “863项目”(2006AA02Z216)*通讯作者。

Tel/Fax: +86-22-60272182; E-mail: ningch@作者简介: 黄金(1979− ), 男, 安徽亳州人, 博士研究生, 研究方向为代谢工程。

E-mail: huangjin_979@ 收稿日期: 2008-03-20; 修回日期: 2008-05-09ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 不同溶氧条件下L-苏氨酸生物合成菌株的代谢流量分析黄金1，徐庆阳1，温廷益1,2，陈宁1*(1天津科技大学生物工程学院，天津 300457) (2中国科学院微生物研究所，北京 100101)摘要：【目的】探索L-苏氨酸生物合成机理及影响因素。

【方法】建立了大肠杆菌L-苏氨酸的代谢流平衡模型，应用MATLAB 软件计算出不同溶氧条件下发酵中后期代谢网络的代谢流分布及理想代谢流分布。

【结果】5%溶氧条件下，25.5%碳架进入HMP 途径，74.5%碳架进入糖酵解途径，获得33.9%质量转化率；20%溶氧条件下，58.08%碳架进入HMP 途径，41.92%碳架进入糖酵解途径，获得46.5%质量转化率；【结论】与理想代谢流（88.23%质量转化率）相比，应从菌种改造和发酵控制方面通过改变6-磷酸葡萄糖异构酶借以增加HMP 途径代谢流量，通过增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应代谢流提高天冬氨酸族合成代谢流，减少TCA 循环代谢流量，从而达到减少副产物生成，增加L-苏氨酸生物合成的目的。

关键词：L-苏氨酸；溶氧；代谢流分析；大肠杆菌中图分类号：Q935 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 (2008) 08-1056-05L-苏氨酸是人与动物体内所必需的一种氨基酸，自身不能合成，必须从食物中摄取，被广泛应用于饲料工业、保健食品和医药工业[1,2]。