常用细胞培养基配方及缓冲液

常用缓冲液及培养基配方LB液体培养基：Bacto-蛋白胨10g酵母抽提物5g氯化钠10g加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。

LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。

SOB液体培养基Bacto-蛋白胨20g酵母抽提物5gNaCl 0.5g加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至7.0，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。

使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。

SOC液体培养基SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。

麦康凯固体培养基每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。

NA固体培养基牛肉浸膏3g酵母浸膏1g蛋白胨蔗糖琼脂粉5g 10g 15g加950ml蒸馏水溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。

TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：Bacto-蛋白胨12g酵母抽提物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/ 0.72 mol/L K2HPO4的溶液。

高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。

溶液Ⅰ葡萄糖2.25 g 50mmol/L1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L调pH至8.0后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。

溶液Ⅱ10 mol/L NaOH 2ml10% SDS 10ml用水定容至100 ml，现配现用。

溶液Ⅲ5 mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml高压灭菌后保存。

高盐TE缓冲液10mmol/L Tris.Cl, pH 8.0*0.1mmol/L EDTA, pH 8.0*1mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB抽提液2%（w/v）CTAB(古立烷基三乙基溴化铵)100mmol/L Tris.Cl,pH 8.0 *1.4mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB/0.7mol/L NaCl）在80ml H2O中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10一CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。

常用缓冲液及培养基配方缓冲液和培养基是生物学实验中常用的重要试剂，它们的配方的选择对实验结果有着重要的影响。

下面将介绍几种常用的缓冲液和培养基的配方及其用途。

一、缓冲液配方1.磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液常被用于细胞培养和生物化学实验中，它的使用范围很广。

常用的磷酸盐缓冲液有PBS（磷酸盐缓冲盐水），配方如下：-NaCl8g-KCl0.2g-Na2HPO41.42g-KH2PO40.24g将以上物质溶解在1L的去离子水中，pH值调到7.4，即可得到1×PBS缓冲液。

2. Tris缓冲液Tris缓冲液在分子生物学实验中常被用作DNA和RNA电泳的产物混合液。

常用的Tris缓冲液有Tris-HCl缓冲液和Tris-acetate缓冲液。

以下是Tris-HCl缓冲液的配方：- Tris 12.1 g-HCl(10M,pH7.6)10mL将Tris和HCl分别溶解在800 mL去离子水中，然后添加水调至1 L，pH值调节到目标值即可。

Tris-acetate缓冲液的配方与Tris-HCl相似，只是在Tris-HCl的基础上添加乙酸。

3. Glycine缓冲液Glycine缓冲液常被用于电泳实验中，用于电泳缓冲液和电泳媒介液的制备。

以下是Glycine缓冲液的配方：- Glycine 3 g- Tris 4.8 g-SDS0.207g-EDTA0.37g将以上物质溶解在1 L的去离子水中，pH值调至8.3，即可得到1×Glycine缓冲液。

1.LB培养基LB培养基是最常用的细菌培养基之一，用于培养大肠杆菌等革兰氏阴性菌。

以下是LB培养基的配方：- Tryptone 10 g- Yeast extract 5 g-NaCl10g将以上物质溶解在1L的去离子水中，加热至溶解，然后进行高压灭菌即可得到LB培养基。

2.M9培养基M9培养基是一种缺乏氮、氨基酸和碳的最小培养基，常被用于重组DNA的传输。

实验室常用试剂缓冲液配制方法一览表实验常用试剂、缓冲液的配制方法1、1MTri-HCl□组份浓度1MTri-HCl（pH7.4，7.6，8.0）□配制量1L□配置方法1.称量121.1gTri置于1L烧杯中。

2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。

pH值浓HCl7.4约70mL7.6约60mL8.0约42mL4.将溶解定容至1L。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tri溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2、1.5MTri-HCl□组份浓度1.5MTri-HCl（pH8.8）□配制量1L□配置方法1.称取181.7gTri置于1L烧杯中。

2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3.用浓盐酸调pH值至8.8。

4.将溶液定容至1L。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tri溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

3、10某TEBuffer□组份浓度100mMTri-HCl，10mMEDTA（pH7.4，7.6，8.0）□配制量1L□配置方法1.量取下列溶液，置于1L烧杯中。

1MTri-HClBuffer（pH7.4，7.6，8.0）100mL500mMEDTA（pH8.0）20mL2.向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。

3.将溶液定至1L 后，高温高压灭菌。

4.室温保存。

4、3M醋酸钠□组份浓度3M醋酸钠（pH5.2）□配制量100mL□配置方法1.称取40.8gNaOAc3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。

2.加入冰乙酸调节pH值至5.2。

3.加入去离子水将溶液定容至100mL。

4.高温高压灭菌后，室温保存。

5、PBSBuffer□组份浓度137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，2mMKH2PO4□配制量1L□配置方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯中。

实验常用试剂、缓冲液的配制方法1、1M Tris-HCl□组份浓度1 M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）□配制量1L□配置方法1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。

pH值浓HCl7.4 约70mL7.6 约60mL8.0 约42mL4. 将溶解定容至1L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2、1.5 M Tris-HCl□组份浓度1.5 M Tris-HCl（pH8.8）□配制量1L□配置方法1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调pH值至8.8。

4. 将溶液定容至1L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

3、10×TE Buffer□组份浓度100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA （pH 7.4，7.6，8.0）□配制量1L□配置方法1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。

1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0）100mL500 mM EDTA（pH8.0）20mL2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。

3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

4、3 M 醋酸钠□组份浓度3 M 醋酸钠（pH5.2）□配制量100mL□配置方法1. 称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。

2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。

3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。

（一）WB相关试剂及常用缓冲液●●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度）AP粉末 1gddH20 10ml●10％SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS粉末 10gddH20定容到 100ml注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡●6X蛋白质sample bufferTris-HCl(1M,pH6.8) 30mLSDS 10g甘油 30mLDTT（154.25） 9.3g溴酚蓝 0.06gdd H20 定容至100mL●10XPBS缓冲液的配制：NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4g（十二水合36g）KH2PO40 2.4g加800 mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4，调好pH再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度●PBST(1X)PBS(1X) 500mlTween 20 500μl●50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量Tris粉末 242g冰醋酸 57.1mlNa2EDTA·2H2O 37.2gddH20定容到 1L●封闭液脱脂奶粉 5g叠氮钠 0.02g(现配现用时可不加)PBS 定容到100mL●脱色液：(室温)甲醇 165mL乙酸 50 mLH20 785 mLddH20 定容至1L●TBST(1X)TBS(1X) 500mlTween 20 500μl●Stripping buffer(可反复利用)温老师组配方10%SDS 10mlΒ-巯基乙醇 350 lTris-HCI（pH6.8） 6.25ml（6.06加到50mL水）加入ddH2O 至50mL●Stripping buffer(可反复利用)郭老师给配方甘氨酸 15gSDS 1gTween20 1mldd ddH2O 1L作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。

（二）细胞和细菌培养基、抗生素●SOB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨 20g酵母提取物 5g氯化钠 0.5g1mol/L氯化钾 2.5ml用水补足体积到1L。

实验室常用细胞表征及处理方法一、细胞培养1.1细胞培养基配方普通细胞所需要的培养基配方主要为：购买的培养基+10 %血清（小牛或者胎牛）+1%双抗。

（常用的双抗及胰酶建议直接购买）1.2细胞传代1.2.1洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加入2~3ml PBS缓冲液洗涤2-3次，摇晃使其均匀铺满整个平面，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的血清和死细胞。

1.2.2消化：加入适量（盖满细胞层表面即可，25cm2的培养瓶加入0.5-0.6mL 即可，75 cm2加入1.0mL）的0.25%胰蛋白酶液，轻轻摇晃，普通细胞一般需要60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37℃孵箱孵育适当的时间，如Hela细胞大约需要30s-40s，翻转培养瓶。

然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况,待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙，即可终止消化（若细胞成片收缩，倒去消化液）。

若存在细胞团，可以轻轻拍打培养瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会非常困难。

1.2.3终止消化：在培养瓶中加入1-3ml培养液（胰酶遇血清会终止其活性）以终止消化。

用吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边角部分特别注意多次吹打。

可在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。

将单细胞悬液移入15ml离心管内,离心1000r×5min,弃去上清液,加入5ml 培养基进行吹打重悬（也可不用离心，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶里，补加适量培养基）。

小培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养皿5-7ml，以上均应视细胞的数目而定，细胞多，可适当加多些培养基）。

1.2.4.传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进行细胞悬液计数，然后按所需密度接种到其它培养瓶中。

标注上代数、日期及操作人。

注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋白酶液均需37℃预热处理。

常用细胞培养基配方及缓冲液细胞培养基是为了在体外维持细胞生长和增殖所设计的一种营养液。

细胞培养基的配方要求提供细胞所需的基本营养物质，如氨基酸、糖类、维生素和激素，并提供适当的pH和离子平衡。

同时，缓冲液也是细胞培养过程中不可或缺的一部分，用于稳定细胞培养基的pH，维持细胞正常的生长环境。

下面列举几种常用的细胞培养基配方及缓冲液：1. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)-细胞培养基配方：-DMEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：无2. RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute Medium) -细胞培养基配方：-RPMI1640培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)溶液，浓度为25mM，用于稳定pH。

3. MEM (Minimum Essential Medium)-细胞培养基配方：-MEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)- 缓冲液：盐酸/NaOH缓冲体系，通常用NaHCO3/N-2-羟乙基piperazine-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲。

4. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)-细胞培养基配方：-HBSS培养基粉末-对应体积的无菌水-缓冲液：无5. L-15 Medium (Leibovitz's L-15 Medium)-细胞培养基配方：-L-15培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。

6. DMEM/F12 Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F-12 Medium)-细胞培养基配方：-DMEM/F12培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。

常用缓冲液及培养基配方LB液体培养基：Bacto-蛋白胨10g酵母抽提物5g氯化钠10g加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。

LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。

SOB液体培养基Bacto-蛋白胨20g酵母抽提物5gNaCl 0.5g加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至7.0，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。

使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。

SOC液体培养基SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。

麦康凯固体培养基每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。

NA固体培养基牛肉浸膏3g酵母浸膏1g蛋白胨蔗糖琼脂粉5g 10g 15g加950ml蒸馏水溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。

TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：Bacto-蛋白胨12g酵母抽提物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/ 0.72 mol/L K2HPO4的溶液。

高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。

溶液Ⅰ葡萄糖2.25 g 50mmol/L1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L调pH至8.0后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。

溶液Ⅱ10 mol/L NaOH 2ml10% SDS 10ml用水定容至100 ml，现配现用。

溶液Ⅲ5 mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml高压灭菌后保存。

高盐TE缓冲液10mmol/L Tris.Cl, pH 8.0*0.1mmol/L EDTA, pH 8.0*1mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB抽提液2%（w/v）CTAB(古立烷基三乙基溴化铵)100mmol/L Tris.Cl,pH 8.0 *1.4mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB/0.7mol/L NaCl）在80ml H2O中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10一CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。

常用细胞培养基配方及缓冲液细胞培养基是一种含有适当营养物质和生长因子的液体或凝胶，用于维持细胞的生长与繁殖。

常用的细胞培养基配方和缓冲液如下：一、常用的细胞培养基配方：1. DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）-DMEM是最常用的细胞培养基之一，适用于多种种类的细胞培养。

-基本配方：-高糖DMEM：添加25mM葡萄糖-低糖DMEM：添加5.5mM葡萄糖-高氨基酸DMEM：添加高浓度的氨基酸，以促进细胞生长和蛋白质合成。

2.RPMI1640-适用于淋巴细胞和一些肿瘤细胞的培养。

-基本配方：-高糖RPMI1640：添加25mM葡萄糖-低糖RPMI1640：添加5.5mM葡萄糖-高氨基酸RPMI1640：添加高浓度的氨基酸。

3. MEM（Minimum Essential Medium）-MEM是最早用于细胞培养的培养基。

-基本配方：-高糖MEM：添加25mM葡萄糖-低糖MEM：添加5.5mM葡萄糖4. Ham's F-10-适用于肿瘤细胞和一些原代细胞的培养。

-基本配方：- 高糖Ham's F-10：添加25mM葡萄糖- 低糖Ham's F-10：添加5.5mM葡萄糖5.L-15-适用于多种种类的细胞培养。

-基本配方：- L-15培养基：必须在CO2-free环境下使用。

二、常用的缓冲液：1. 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）-0.1MPBS的配方：-8gNaCl-0.2gKCl-1.44gNa2HPO4-0.24gKH2PO4-1L去离子水-调pH至7.42.HEPES缓冲液-基本配方：-119mMNaCl-5mMKCl-0.8mMMgSO4-0.4mMKH2PO4-2.4mMNaHCO3-20mMHEPES（pH7.4）-0.6mMCaCl23. Tris缓冲液-基本配方：- 25mM Tris- 192mM glycine-10%甘油-0.1%SDS-pH8.34. Hanks平衡盐液 (HBSS)-基本配方：-8gNaCl-0.4gKCl-0.146gKH2PO4-0.2gMgSO4-0.06gMgCl2-0.35gNaHCO3-0.06gNa2HPO4-pH7.45. Tris-EDTA-基本配方：- 1M Tris-HCl，pH 8.0-0.5MEDTA，pH8.0以上是常用的细胞培养基配方和缓冲液的一些例子，不同细胞类型和实验要求可能需要不同的培养基和缓冲液。

五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin（氨卡青霉素)(100 mg/ml）组份浓度100 mg/ml Ampicillin配制量50 ml配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后,定容至50 ml.3。

用0.22 µm过滤膜过滤除菌。

4。

小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。

IPTG(异丙基—β-D—硫代半乳糖苷）（24 mg/ml）组份浓度24 mg/mL IPTG配制量50 mL配制方法1。

称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。

2。

加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3。

用0 22 µm过滤膜过滤除菌.4小份分装（1 ml，份)后，—20℃保存。

X-Gal (20 mg/ml）组份浓度20 mg/ml X—Gal配制量50 ml配制方法1。

称量l g X—Gal置于50 ml离心管中。

2。

加入40 ml DMF（二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.小份分装（1 ml/份）后，—20℃避光保存。

LB培养基组份浓度1%（W/V）Tryptone(胰蛋白胨)，0。

5％(W/V）Yeast Extract（酵母提取物），1％（W/V）NaCl配制量 1 L配制方法123。

滴加5 N NaOH（约0.2 m1），调节pH值至7。

0.4。

加去离子水将培养基定容至1 L。

5高温高压灭菌后，4。

C保存.LB/Amp培养基组份浓度配制量 配制方法1 2 3。

滴加5 N NaOH(约0。

2 mL ）。

调节pH 值至7.0.4。

加去离子水将培养基定容至1 L.5.高温高压灭菌后,冷却至室温.6.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均匀混合。

7.4℃保存。

TB 培养基组份浓度 配制量1.L 配制方法 1。

配制磷酸盐缓；中液(0。

17 M KH 2PO4，0。

分子实验常用试剂、缓冲液的配制方法配置方法1.称量121.1gTris 置于1L 烧杯中。

2. 加入约800mL 的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH 值。

pH 值4. 将溶解定容至1L 。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定 pH 值，因为Tris 溶液的液的pH 值大约降低0.03个单位。

2. 加入约800mL 的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调pH 值至8.8。

4.将溶液定容至1L 。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH 值，因为Tris 溶液的pH 值随温度的变化差异很大， 温度每升高1 C,溶液的pH 值大约降低0.03个单位。

1 M Tris-HCl Buffer （pH7.4，7.6，8.0 ）100mL500 mM EDTA ( pH8.0 ) 20mL2. 向烧杯中加入约800mL 的去离子水，均匀混合。

3. 将溶液定至1L 后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

4. 高温高压灭菌后，室温保存。

配制量1L配置方法1.称量下列试剂，置于1L 烧杯中。

NaCl 0.2g Na2HPO4KH2PO42. 向烧杯中加入约800 mL 的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加HCI 将pH 值调节至7.4，然后加入7.4 7.6 约 70mL 约 60mL 8.0约 42mL2、1.5 M Tris-HCI 组份浓度 1.5 M Tris-HCI(pH8.8 )配置方法 配制量1L1.称取181.7gTris 置于1L 烧杯中。

1、1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0 ） 组份浓度 1 M Tris-HCl配制量1L浓HCI pH 值随温度的变化差很大， 温度每升高「C,溶3、10 X TE Buffer （pH 7.4 , 7.6 , 8.0）组份浓度 100 mM Tris-HCl ，10 mM EDTA 配制量1L配置方法1. 量取下列溶液，置于1L 烧杯中。

实验室常⽤细胞表征及处理⽅法（实战版）实验室常⽤细胞表征及处理⽅法⼀、细胞培养1.1细胞培养基配⽅普通细胞所需要的培养基配⽅主要为：购买的培养基+10 %⾎清（⼩⽜或者胎⽜）+1%双抗。

（常⽤的双抗及胰酶建议直接购买）1.2细胞传代1.2.1洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加⼊2~3ml PBS缓冲液洗涤2-3次，摇晃使其均匀铺满整个平⾯，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的⾎清和死细胞。

1.2.2消化：加⼊适量（盖满细胞层表⾯即可，25cm2的培养瓶加⼊0.5-0.6mL 即可，75 cm2加⼊1.0mL）的0.25%胰蛋⽩酶液，轻轻摇晃，普通细胞⼀般需要60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37℃孵箱孵育适当的时间，如Hela细胞⼤约需要30s-40s，翻转培养瓶。

然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况,待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙，即可终⽌消化（若细胞成⽚收缩，倒去消化液）。

若存在细胞团，可以轻轻拍打培养瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会⾮常困难。

1.2.3终⽌消化：在培养瓶中加⼊1-3ml培养液（胰酶遇⾎清会终⽌其活性）以终⽌消化。

⽤吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边⾓部分特别注意多次吹打。

可在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。

将单细胞悬液移⼊15ml离⼼管内,离⼼1000r×5min,弃去上清液,加⼊5ml 培养基进⾏吹打重悬（也可不⽤离⼼，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶⾥，补加适量培养基）。

⼩培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养⽫5-7ml，以上均应视细胞的数⽬⽽定，细胞多，可适当加多些培养基）。

1.2.4.传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进⾏细胞悬液计数，然后按所需密度接种到其它培养瓶中。

标注上代数、⽇期及操作⼈。

注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋⽩酶液均需37℃预热处理。