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高通量测序技术的生物信息学分析引言：高通量测序技术作为一种新型基因测序技术，已经被广泛应用于现代生物研究中。
利用高通量测序技术，科学家们可以快速解码基因组序列、转录组序列以及蛋白质组序列。
然而，高通量测序技术不仅仅是一种实验技术，它也需要强大的生物信息学工具来支持数据分析和解读。
本文将介绍高通量测序技术的生物信息学分析，包括原始数据质量控制、序列比对和注释、基因表达分析、基因变异分析等等。
一、原始数据质量控制原始数据质量控制是高通量测序数据分析的第一步，其目的是剔除低质量序列以及包含污染序列的读段，确保下游的数据分析结果准确可靠。
利用FASTQC等软件对原始的FASTQ格式数据进行质量评估，可以得到关于以下几个质量指标的信息：1. GC含量2. Q20和Q30的比例3. 碱基分布的均匀性4. 过度重叠序列的比例基于以上质量指标，可以对数据进行质量控制处理，包括碱基修剪、低质量序列过滤、去除污染序列等等。
二、序列比对和注释序列比对指的是将高通量测序数据基因组参考序列进行比对，得到参考序列上的SNP、InDel的信息，从而对样品进行全面的基因变异检测、注释和分析。
在序列比对和注释的过程中，需要正确选择合适的比对软件和参考序列。
目前较为流行的比对软件包括BWA、Bowtie、STAR等等。
针对RNA-seq数据的注释工具包括Cufflinks、StringTie、Transcriptome Assembly等等。
基于参考序列的比对结果，还可以利用Variant Effect Predictor (VEP)等工具对候选变异位点进行注释。
注释信息包括dbSNP、ClinVar、ExAC等公共数据库的信息，帮助生物学家了解该变异的生物学特性，并识别其潜在的影响。
三、基因表达分析高通量测序技术还可以用于RNA表达谱的分析，以揭示不同组织和不同发育阶段的基因表达差异。
在基因表达分析中，首先将RNA-seq数据进行质量控制和过滤，然后对序列进行比对和注释，获得基因的计数信息。
生物信息学中的高通量测序数据分析研究在生物学领域中，随着人们对生物系统的研究日益深入，高通量测序技术的出现为基因和蛋白质序列的鉴定和分析提供了非常有效的手段。
高通量测序数据分析研究作为生物信息学领域中的一个重要分支，以其高效、快速、准确的特性，不断地吸引着研究者的关注。
高通量测序技术是指一种能够同时测定大量DNA序列的方法，它不仅能够用于基因组组装和注释，还可以通过RNA测序技术来分析基因表达。
这种技术极大地加快了生物学研究的速度和效率，为生物学家提供了大量的测序数据。
然而，这些数据的处理和分析却是非常复杂的。
首先，高通量测序数据的预处理是数据分析的第一步。
当测序数据被生成后，必须对其进行质量控制、过滤低质量序列、去除接头序列等处理，才能得到较为准确的数据。
此外，还有一些其他的预处理过程，例如去重、去序列污染等。
接着，对于各类高通量测序数据进行生物信息学分析非常关键。
生物信息学分析的主要目的是确定基因或蛋白质序列，并了解它们在不同生理状态下的表达和功能。
对于RNA测序数据，其主要方法是将原始数据经过拼接或比对成转录本，然后对得到的转录本进行表达量分析，从而确定不同表达和差异表达基因的信息。
而对于DNA测序数据，则可通过基因组拼装、变异分析、基因预测和功能注释等方法进行深入研究。
近年来，生物信息学领域发展迅速，高通量测序数据分析也成为了该领域中的一个热门研究方向。
许多学者正在研究开发更加准确、更加高效、更加专业的分析工具和方法。
例如，结合机器学习技术的表达量分析方法和差异表达基因分析，能够更加准确地发现差异表达的基因；metagenomics（环境微生物组学）领域，则还需要研究多样性分析、代谢通路分析等更为复杂的问题。
总之，高通量测序数据分析是一个关键的研究领域，它为更深入、全面的生物学研究提供了非常重要的工具和方法。
未来，生物信息学领域需要进一步发展，带来更多的高精度、高效率的数据处理和分析技术，以满足更严格的生物学研究需求。
生物信息学中的高通量基因测序数据处理与分析随着高通量基因测序技术的发展，大量的基因测序数据得以产生。
这些数据对于生物信息学的研究和应用具有重要意义，因此高通量基因测序数据的处理与分析成为了生物信息学领域的重点之一。
高通量基因测序数据处理是指对原始的测序数据进行加工、清洗和预处理的过程。
首先，需要将测序数据从测序仪中读取出来，得到序列文件。
接着，需要对序列文件进行质量控制，去除低质量序列，过滤掉可能的污染和重复序列。
其次，对于RNA测序数据，需要对序列进行去除adaptor序列、多态性核苷酸等预处理步骤。
最后，对于基因组测序数据，还需要进行比对到参考基因组的工作。
高通量基因测序数据的处理过程中，还需要注意到错误和偏倚的存在。
测序错误可以来源于测序仪的误差，也可以来源于PCR扩增的偏差。
针对这些问题，研究人员可以利用错误纠正算法和统计模型来识别和修复错误的测序数据。
同时，也可以通过样本间和实验间的重复测序来评估和控制测序的偏差。
处理完高通量基因测序数据之后，研究人员就可以进一步进行数据分析。
高通量基因测序数据的分析主要包括基因定量和差异表达分析、基因组注释和变异分析、及关联分析和机器学习等。
基因定量分析可以通过计算读数或转录本的丰度来研究基因的表达模式；差异表达分析可以用于比较不同条件或组织中基因的表达差异，从而找出与特定生物过程或疾病相关的基因。
基因组注释分析可以将基因定位到基因组中的特定位置，并评估基因功能和调控元件的存在。
变异分析可以用于检测和注释基因组中的突变和多态性，研究其与疾病相关性，以及对个体差异的贡献。
关联分析和机器学习可以挖掘大规模测序数据中的相关性和模式，为生物学研究提供新的理解和预测。
为了更好地处理和分析高通量基因测序数据，研究人员还需要掌握一些常用的生物信息学工具和算法。
例如，常用的序列比对算法包括BLAST、Bowtie、BWA等；基因定量和差异表达分析可使用DESeq2、edgeR、limma 等；基因组注释可利用Ensembl、NCBI、UCSC等数据库和工具。
基于高通量测序技术的生物信息学解读高通量测序技术是近年来生命科学和医学领域的重要技术之一，通过对生物样品进行深度测序，能够快速、准确地获取大量生物信息，为基因功能研究、药物研发、疾病诊断和治疗等方面提供了有力支撑。
生物信息学解读是高通量测序技术的重要应用方向之一，涉及到基因组、转录组、蛋白质组等多个层次的分析，具有广泛的研究意义和应用前景。
一、基因组测序基因组测序是高通量测序技术的首要应用方向之一，它能够帮助我们了解生物基因组的组成、结构和功能，为基因功能研究、进化分析等提供数据支持。
与传统方法相比，基因组测序能够在较短时间内对生物基因组进行全面测序，解决了单个基因或单个基因片段测序的限制性问题，提供了更加全面的基因数据。
基因组测序分为宏基因组和微基因组两种。
宏基因组是对各种微生物和大量环境中存在的微生物进行的基因组测序，其目的是揭示微生物种类、多样性、功能等。
微基因组则是对个体或种群的基因组进行的测序，不少研究工作集中在人类基因组的测序上。
基因组测序需要进行序列的拼接、比对、注释等信息学处理才能明确基因组结构和组成。
二、转录组测序转录组是指在细胞内基因转录生成mRNA的总体酶同一时刻产生的所有mRNA分子的总和。
与基因组测序相比，转录组测序可以更加全面地了解生物转录水平的变化。
通过测定生物转录组，可以揭示生物发育、生长、适应环境变化等方面的生物学规律。
在转录组测序中，从样品中提取RNA，然后通过转录组测序技术，对RNA进行深度测序，将结果转化为数字信号，然后进行数据分析和注释，包括基因差异表达分析、聚类分析、功能富集分析等，挖掘生物转录组的生物学意义和作用。
三、甲基化测序在生物体中，DNA甲基化是表观遗传学研究中一个重要的表征，也是人类疾病诊断和治疗的关键因素。
然而，甲基化在不同细胞、组织和环境条件下是动态变化的。
因此，甲基化测序技术可以用来研究DNA甲基化的变化以及与这些变化相关的生物学过程，如基因表达和细胞分化等。
高通量测序生物信息学分析
高通量测序技术产生的DNA序列数据长度较短，而且数据量非常巨大。
分析了高通量测序环境下大数据的挑战和机遇，总结并讨论了数据压缩、宏基因组数据序列拼接、宏基因组数据序列分析方面的算法和工具等研究成果。
最后，展望了高通量测序下DNA短读序列数据研究的发展趋势。
高通量测序分析高通量测序，一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。
主要包括：High-throughput Sequencing，Next Generation Sequencing，Deep Sequencing。
图1 高通量测序流程
高通量测序应用范围广泛：1 DNA测序：全基因组de novo测序，基因组重测序，宏基因组测序，人类外显子组捕获测序。
2 RNA测序：转录组测序，小RNA测序，电子表达谱测序。
3 表观基因组研究：ChIP-Seq，DNA甲基化测序。
基因组测序
基因组测序是对物种的基因组DNA打断后进行高通量测序，根据是否有已知基因组数据主要分为de novo全基因组测序和基因组重测序。
De novo 基因组测序是对未知基因组序列的物种进行基因组从头测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组图谱。
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
图2 基因组测序策略
图3 Paired-end原理。
基于高通量测序的生物信息学分析方法研究随着高通量测序技术的发展，生物学研究的重心已经从单个基因序列的研究转向了大规模基因组和转录组的研究。
高通量测序技术的出现不仅大大降低了生物学研究的成本和时间，而且为生物学领域的研究提供了更加深入、全面的信息。
生物信息学分析作为高通量测序技术的重要组成部分，为研究者提供了多种分析工具和方法，为生物学领域的研究提供了强大的支持。
一、高通量测序技术概述在高通量测序技术中，数据量非常大，需要进行大量的数据处理和分析。
因此，生物信息学分析在高通量测序技术中至关重要。
高通量测序技术包括Illumina、Roche/454、ABI/SOLiD等多种技术，其中Illumina是最常用的测序技术。
Illumina的测序原理是通过选取不同长度的DNA片段来进行序列的测定，将这些片段拼接在一起形成完整的序列。
这种方法具有高产量、高精度、高效率、适用于大规模测序等优点。
二、生物信息学分析方法高通量测序技术所产生的海量数据需要进行深入的分析，生物信息学分析方法正是为这些分析工作提供有效手段的重要组成部分。
生物信息学分析方法可分为基本分析、预测分析和差异分析等几个方面。
1. 基本分析生物信息学基本分析主要分为数据预处理和序列的比对两个部分。
在数据预处理方面，主要包括质控、去除低质量序列、去除适配器、去除含有未知碱基序列的数据、序列长度筛选和低频序列处理等步骤。
在序列比对方面，主要包括基于参考序列和基于无参考序列的两种比对方式。
基于参考序列的比对方式可以使用Bowtie、BWA等较为常用的软件；基于无序参考序列的比对方式，可以使用SOAP、TopHat等软件。
2. 预测分析预测分析是通过基因结构预测、蛋白质结构和功能预测等手段进行分析。
基因结构预测的方法主要有基于比对和基于组装两种方法，通过分析基因转录模式、隐含马尔科夫模型、比对到参考序列的拼接方向等方面进行预测。
蛋白质结构和功能预测则可以通过使用大量的基因组序列和蛋白质数据库，结合计算机预测和实验验证等方法进行预测。
附件三生物信息学分析一、基础生物信息学分析1.有效测序序列结果统计有效测序序列：所有含样品barcode（标签序列）的测序序列。
统计该部分序列的长度分布情况。
注：合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。
图形示例为：2.优质序列统计优质序列：有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。
统计该部分序列的长度分布情况。
图形示例为：3.各样本序列数目统计：统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。
结果示例为：4.OTU生成：根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。
5.稀释曲线（rarefaction 分析）根据第4条中获得的OTU数据，做出每个样品的Rarefaction曲线。
本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。
rarefaction曲线结果示例：6.指数分析计算各个样品的相关分析指数，包括：•丰度指数：ace\chao•多样性指数：shannon\simpson•本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。
多样性指数分析结果示例：注：默认分析以上所列指数，如有特殊需要请说明。
7.Shannon-Wiener曲线利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。
当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。
绘制默认水平为：0.03。
例图：8.Rank_Abuance 曲线根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。
结果文件默认为PDF格式（其它格式请注明）。
例图：9.Specaccum物种累积曲线（大于10个样品）物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。
高通量基因测序数据的生物信息学研究高通量基因测序技术近年来在生物学领域得到广泛应用，为基因组学、转录组学和蛋白质组学等领域的研究提供了强有力的工具。
基于高通量测序技术得到的海量数据，生物信息学研究助力于深入挖掘数据内在的生物学信息，为生物学研究和应用提供新的观点和方法。
本文就高通量基因测序数据在生物信息学研究中的应用、算法和软件工具等方面进行探讨。
一、高通量基因测序数据高通量测序技术以短时间、高通量、高准确性、低成本及复杂样品等特点，成为当前基因测序领域的主流技术。
它可以从混合的DNA或RNA中高效、快速地检测出许多序列，并通过计算机分析得到基因组、转录组、蛋白组等多个维度的生物信息。
高通量基因测序过程包括准备样品、建库、测序和数据分析等步骤。
每一步都影响测序质量和数据结果。
二、生物信息学研究在高通量基因测序中的应用高通量基因测序技术生成的数据量通常具有大规模、高维度和高复杂性个特点，需要借助生物信息学来解决这些问题的挑战。
生物信息学研究在高通量基因测序数据中的应用有很多方面，其中最常见的就是：1. 非编码RNA鉴定及功能分析非编码RNA是指不具有编码蛋白的功能的RNA分子，包括长链非编码RNA （lncRNA）、微小RNA（miRNA）以及很多种RNA。
二代测序技术可以深入、高通量地检测出各种类型的非编码RNA，但其功能尚不明确。
生物信息学方法可以通过结合不同的公共数据库和生产软件，预测和鉴定非编码RNA特征，分析其在细胞周期、生长发育等方面调控基因表达的作用及机制。
2. 基因组重测序及变异检测基因组重测序是指在已知的组装序列上重新测序，并将得到的数据与已知的序列进行比较，以检测个体间的遗传变异。
基于高通量基因测序技术，可以大规模地进行基因组重测序，并利用生物信息学方法分析变异位点的发现和功能注释。
这有助于检测基因组重测序对功能区、副本数等的影响，以及识别疾病相关的致病基因或易感位点。
3. 转录组分析转录组数据是高通量基因测序技术的典型应用之一。
基于高通量测序的生物信息学分析研究生物信息学作为一门新兴的交叉学科，涉及到生物、计算机科学、数学和统计等多个领域。
其中，高通量测序技术是生物信息学发展的重要基础，它是通过自动化、高速、高灵敏度的方法分析DNA或RNA的序列信息，从而深入掌握生命体系的遗传信息。
在这篇文章中，将着重探讨基于高通量测序的生物信息学分析研究。
一、高通量测序技术的基本概念高通量测序技术也被称为次代测序技术，与传统的Sanger测序技术相比，它可以高速、高效、低成本地完成海量基因组、转录组或RNA-Seq等样本的测序。
同时，高通量测序技术也不断发展，并出现了Illumina、Ion Torrent、PacBio等类别的次代测序平台，为生物信息学研究提供了更加多元的数据来源。
二、高通量测序技术的应用领域高通量测序技术的应用领域非常广泛，包括基因组测序、转录组测序、RNA-Seq、染色体捕获、外显子组、甲基化分析、比较基因组学研究等。
这些研究可以用于深入研究生命体系的基因功能、生物进化和疾病发生机制等重要问题。
三、高通量测序的数据分析方法高通量测序技术生成的数据量很大，需要进行一系列的数据分析，以便从生物学的角度理解数据。
这些分析包括序列质量控制、数据清洗、序列比对、差异分析、功能注释、基因富集分析等。
其中，数据清洗和序列比对是高通量测序数据分析的重要步骤，主要是为了保证数据的质量和准确性，并建立样本之间的比较框架。
四、高通量测序在基因功能研究中的应用基于高通量测序的基因功能研究主要包括转录组测序、RNA-Seq和甲基化分析等。
这些手段可以帮助研究人员深入理解基因调控机制、识别基因表达谱和DNA甲基化谱的变化规律。
通过这些研究，研究人员可以发现与疾病发生和进化相关的基因标记，并为新药研发提供支持。
五、高通量测序在精准医学中的应用高通量测序技术在精准医学中的应用正在逐步展开，在癌症诊疗、遗传病筛查和药物敏感性等方面具有广阔的应用前景。
基因组测序基础知识㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种：1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序；2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序；3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx进行深度测序，完成基因组拼接。
采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。
实验流程：公司服务内容1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头，去污染）；序列组装达到精细图标准2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展示平台搭建1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。
基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。
(2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。
基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。
(3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。
基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。
(4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。
2. De Novo有几种测序方式目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。
在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。
下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。
Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。
单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。
Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。
图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法Mate-pair文库制备旨在生成一些短的DNA片段，这些片段包含基因组中较大跨度(2-10 kb)片段两端的序列，更具体地说：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-10 kb范围可选）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600 bp 的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠把那些带有生物素标记的片段捕获。
这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成mate-pair文库，然后上机测序(图3)。
图3 Mate pair文库构建方法3.基因组De Novo测序的策略？由于不同物种的基因组大小和复杂程度可能千差万别, 因此全基因组测序可以根据经费预算和基因组预分析结果, 灵活选择不同的测序平台或平台组合。
(1) 在基因组较小的物种测序计划中可以选择Roche 454 或Solexa测序平台。
(2) 对于复杂的植物大基因组可以选择两种或以上的测序平台测序，通常利用 Roche 454 的鸟枪法测序完成基因组的初步组装, 产生 454 contigs, 然后利用Solexa或 ABI SOLiD 的双末端测序数据确定 454 contigs 之间的顺序和方向, 形成 scaffolds。
最后利用Solexa或ABI SOLiD数据填充部分 contigs 之间的空隙, 是一个比较合理和经济的测序策略。
(3) 另外，由于Solexa的读长已经升级到150 bp，也可以直接利用Solexa的paired-end 和mate-pair两种测序方式结合测序，完成较大物种的基因组拼接。
4.制定测序策略前，如何估算新物种的重复序列结构？一般来说，基因组De Novo采用多种长度的插入片段文库进行拼接，主要是为了跨越不同长度的重复序列，因此，了解基因组中的重复系列结构有助于实验方案的设计。
由于不同物种基因组的重复序列结构分布不同，如人基因组中的重复片段较多，也较长，而果蝇基因组中的重复片段较少，也较短，因此二者采用的拼接策略也略有不用。
新物种的重复序列结构的估计一般是基于近缘物种基因中的重复序列结构，认为系统发育相近的物种，它们的重复序列结构相近。
用一定长度的k-mer为框，连续截取基因组，从而得到一系列的unique cluster和repeat cluster，画出这些cluster的分布图，估算这种长度重复序列的分布，如下图所示，人类基因组中长度在10K以上的重复序列占了很多，而果蝇基因组中则主要集中在100bp~10K范围之内，所以用短序列De Novo组装人类基因组的时候，需要增加插入片段长度为10K的mate-pair数据。
5．如何选择不同的插入片段组合达到最佳？文库构建过程中插入片段的长度选择应考虑以下几个因素：(1) 一般来说短的插入片段用来拼接contigs，而长的插入片段用来搭建骨架(scaffold)；(2) 选择不同的插入片段组合的策略主要是为了跨越不同长度的重复序列区。
不同的生物重复片段分布不一样，举例说明，人基因组中长的重复片段较多、果蝇基因组中短的重复片段较多。
要跨越片段长度较长重复序列，必须选取更大的插入片段双端测序文库，但是长的插入片段文库的偏差较大，不能准确的定位较短重复序列的问题，因此，一般长插入片段和短的插入片段的文库都是需要。
但是，插入片段越长，割胶回收时片段的分布越广。
2k的插入片段至少有1%的偏差，即200bp的偏差。
如下图所示，短插入片段文库基本符合预期，但是长插入片段文库中发现有5%的插入片段在0~500bp的读段，将有可能增加De Novo拼接的错误率。
因此，长插入片段文库的测序深度不建议太大。
(3) 由于没有基因组信息，需要调查近缘物种的重复序列分布，能够帮助实验设计。
详情见问题46.基因组De Novo需要多大的覆盖率？基因组的覆盖率是指测序得到的碱基总量(bp)与基因组大小(Genome)的比值，它是评价测序量的指标之一。
测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。
基因组De Novo测序覆盖率的选择需要考虑测序所采用的策略。
由于物种基因组的大小相差比较大，如细菌、真菌等微生物，其基因组一般比较小，可以单独采用Roche 454(20-30x)或Solexa采用高覆盖率(60×左右)的策略进行测序。
而对于一些基因组比较大(100M以上)的物种(如植物)，会采用一些技术平台组合的方法进行测序。
考虑到平台间的成本差异及各平台的优势，为更经济有效的完成基因组De Novo测序，各种平台的覆盖率选择也不同。
如由于Roche 454测序成本较Solexa和ABI SOLID 4要高，一般在采用Roche 454搭建骨架时覆盖率选择比较低(10×)，然后再用Solexa和ABI SOLID 4进行高覆盖率的测序组装scaffolds和填补gap。
另外，覆盖率的选择还要考虑所选择的测序方式，不同测序方式插入片段的长度有所差异，一般来讲长插入片段文库测序深度不能太大，会影响测序准确度(详见问题5)。
图1 测序量与测序覆盖度的关系图2 覆盖度与contig N50值的关系7哪些因素会影响测序结果的质量？(1)个体的杂合度：个体的杂合度越高，拼接难度越大，甚至可能导致序列无法拼接。
(2)物种基因组的多态性：由于一些物种的个体太小，单个个体提取的基因组DNA的量可能难以满足测序的要求(如一些寄生虫)，如此便需要混合多个个体进行基因组DNA抽提以用于测序。
对于这类情况，需要评估该物种基因组的多态性，如果基因组的多态性太高，会影响后续基因组的拼接。
(3)DNA样本的质量：对于细菌与真菌而言，样品来源一定要单一菌落无污染，动植物样本也要尽量纯合，且无污染，否则会严重影响测序结果的质量。
另外制备基因组不能小于23Kb，如果片段过小，在基因组片段化(Fragment)的过程中容易造成小片段丢失，导致构建的测序文库不能完整的覆盖全基因组，对测序结果产生重大的影响。
(4)另外如果基因组的某些区域的GC含量过高(GC%≥65%)会使测序过程中出现偏向性，导致某些区域的覆盖率太低，从而影响后续的拼接和注释。
(5)对于重复序列过多的物种，大量重复序列的存在会产生许多错误的重叠，造成拼接产生的contigs过短，从而导致结果的严重偏差。
8.全基因组De Novo测序的拼接标准怎样？全基因组De Novo测序拼接国际标准：基因框架图基因组精细图基因组覆盖率>90% 基因组覆盖率>95%基因区覆盖率>95% 基因区覆盖率>98%Contig N50 >5kb Contig N50 >20kbScaffold N50 >20kb Scaffold N50 >300kb单碱基错误率<0.01% 单碱基错误率<0.01%N50 即覆盖50% 所有核苷酸的最大序列重叠群长度，把contig或scaffold从大到小排序，并对其长度进行累加，当累加长度达到全部contig或scaffold长度一半时，最后一个contig或scaffold长度。
