实验 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。

其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。

2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。

通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。

常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。

2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。

这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。

2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。

常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。

通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。

3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。

3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。

这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。

3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。

在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。

4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。

通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。

通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。

实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。

引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。

然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。

感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。

本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。

材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。

2. 培养基：LB培养基。

3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。

4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。

5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。

结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。

通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。

然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。

转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。

最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。

为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。

将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。

通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。

实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。

感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。

通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。

本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。

实验四：大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。

二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。

而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。

目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。

主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。

证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。

有人根据pBR322 质粒DNA对E·coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：（1）大肠杆菌受体菌培养时间为OD550=0.2—0.3（5—6107细胞/毫升）最好；（2）菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；（3）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；（4）菌体在pH 为6.0 的溶液悬浮时最为适宜。

分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。

体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。

本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。

进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。

而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。

感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。

本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。

大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化及铺平板筛选转化子一、实验目的了解大肠杆菌感受态细胞制备、质粒转化大肠杆菌、转化子筛选的原理和一般方法。

二、实验原理质粒是基因工程的常用载体，携带外源基因的质粒可进入经过一定处理、容易接受外源基因的受体细胞，即感受态细胞，并在受体细胞内扩增（基因克隆）或表达外源基因（基因表达）。

质粒载体或携带外源基因的质粒进入受体细胞的过程称为转化，质粒转化的受体细胞称为转化子。

（一）制备感受态细胞常用方法：1.电击法（电穿孔法）。

电转法需要仪器，超螺旋质粒转化效率大于109转化子 /μgDNA)。

2.化学诱导法：a. CaCl2法：CaCl2试剂便宜、易得，超螺旋质粒转化效率大约为106－108转化子 /μgDN。

b. PEG法：PEG法制备方法更简便（一步完成），超螺旋质粒转化效率大约为106－108 转化子 /μgDNA。

（二）关于质粒：1.质粒是一种寄生于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子。

2.质粒的特点a.在宿主细胞中，质粒一般以超螺旋共价闭环DNA分子b.能自主复制、但其复制受到宿主细胞的控制，需要利用宿主的酶系统。

c.复制产物可正确分配给子代细胞3.质粒的用途: 主要作为基因重组的一种载体。

4.提取质粒的大致过程：扩增宿主菌：加适宜的抗生素（特异抗生素、氯霉素）。

裂解宿主菌：碱处理法、加热处理法、去污剂处理法、酶法。

提取质粒：变性沉淀其他物质、分离质粒。

纯化质粒：琼脂糖凝胶电泳、离子交换层析、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心。

5.选择裂解方法原则选择裂解方法主要取决于质粒的大小。

(1)大质粒(大于15kb)选用缓和裂解法。

用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解原生质体。

(2)小质粒用较剧烈的方法分离。

在加入EDTA后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。

受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。

大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。

在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。

因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。

感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。

2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。

•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。

3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。

电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。

2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。

3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。

以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。

感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。