(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备步骤：
1．划线，出单菌落。

2．挑取单菌落，接种于5ml psI液体培养基中（试管），37℃振荡培养12h左右，直至对数生长后期。

3．转接，取菌悬液以1%的比例接种于100ml psI液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。

4．OD值达到后，取下摇瓶冰上放置20min。

5．将培养液转入50ml离心管中，4℃，5000rpm，离心10min。

6．弃上清，用0.4倍体积冰冷的溶液I轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下5000rpm 离心10min。

7．弃上清，加入0.04倍体积的溶液II，轻轻悬浮细胞，冰上放置15min，即成感受态细胞悬液。

8．感受态细胞分装成100μl的小份，贮存于-80℃。

溶液与试剂
1.psI培养基配制：
酵母提取物5g，胰蛋白胨20g，MgSO4 7H2O 5g，定容至1000ml，用KOH调pH=7.6 2.溶液I配制：
将5g RbCl，1M KAc 12.3ml，1M CaCl2 4.1ml，1M MnCl2 20.5ml，61.5ml甘油混匀，用0.1M乙酸调pH=5.8，加水定容至410ml。

过滤除菌。

3.溶液II配制：
将1M Mops 1.5ml，1M CaCl2 11.25ml，1M RbCl 1.5ml，22.5ml甘油混合均匀后，1M KOH 调pH=6.5，加超纯水定容至150ml，过滤除菌。

一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。

二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。

感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。

细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。

本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。

在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。

而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。

目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。

主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。

证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。

证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。

有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。

大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~4ml LB液体培养中，37℃振荡培养~12h左右，直至对数生长期。

将该菌悬液以1:100～1:50转接于3 x 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）取培养液50ml转入50ml离心管中，在冰上冷却30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，用15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10Min；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入~15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。

冰浴10 min 后，0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）加入占总体积10％左右高压灭菌过的甘油，混匀后以200 l为单位分装于0.5ml EP 管中，置于-80℃保存。

大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。

下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。

通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。

大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。

2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。

3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。

4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。

5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。

6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。

8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。

9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。

10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。

2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。

2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。

收集菌体，弃上清。

3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。

4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。

5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。

用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。

大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。

在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。

为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。

大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。

常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。

这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。

2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。

接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。

接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。

3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。

培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。

同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。

4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。

离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。

沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。

5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。

冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。

冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。

通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。

这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。

同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。

大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。

通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。

希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。

感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。

2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。

③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。

④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。

二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。

划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。

注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。

②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。

大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。

在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。

感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。

下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。

常用的菌株有DH5α、BL21等。

这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。

2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。

受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。

常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。

构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。

3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。

质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。

常用的质粒有pET、pGEX等。

构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。

4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。

转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。

转化需要进行化学转化、电转化等步骤。

5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。

培养条件包括温度、氧气、营养物质等。

培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。

6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。

为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。

常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。

7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。

功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。

常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。

大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。

这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。

E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。

二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。

注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。

三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。

此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。

四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。

转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。

在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。

注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。

培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。

五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。

2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。

3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。

在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。

Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。

②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。

大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。

【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。

【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。

若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。

3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。

2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。