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大肠杆菌感受态细胞的制备与转化课件

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大肠杆菌感受态细胞制备和转化

大肠杆菌感受态细胞制备和转化

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分 子实 生验
物 学
三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用
CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现 转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那
霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，
则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素
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提高转化效率的几个因素
➢ 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯 水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处
➢ 防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
但制备较复杂，不适合实验室用
➢ 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需
电击仪
➢ CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用
时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下
保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.
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CaCl 2 法制备感受态细胞原理
物 学
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四. 问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细 胞？各有什么优缺点？
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大肠杆菌感受态细胞制备和转化

大肠杆菌感受态细胞制备和转化

DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
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注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
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转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
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实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,

第3章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

第3章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。

为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从—70℃或—20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。

实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
2. 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振荡培养至 OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第5页
试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第6页
CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。

实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
设备：恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；无菌工 作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化ppt课件

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化ppt课件
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实验步骤
➢ 菌株活化 ➢ 感受态细胞制备 ➢ 外源DNA的转化
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实验步骤
菌株活化
1. 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培 养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2. 挑取一个单菌落，转到3－5ml LB培养基中，于 37℃培养3－5小时
3. 将培养液全部转到100ml LB培养基中培养2－3 小时，到OD600＝0.3－0.4
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实验步骤
感受态细胞制备
4. 将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5. 4000rpm离心5min,弃上清 6. 加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7. 4000rpm离心5 min,弃上清 8. 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的 受体细胞( Transformant )。
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实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有 抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受 体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。 将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在 含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体 才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨 苄青霉素的能力而死亡。
统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化
子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化 频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总 体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子 总数／质粒DNA加入量(mg)

第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.

第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.

1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。

☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。

☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。

适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。

制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。

但保存时间过长会使转化效率受到影响。

新鲜细胞4 ℃保存可用5天。

用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。

(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约3小时。

为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。

2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。

3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。

4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

感受态细胞的制备及重组质粒的转化PPT课件

感受态细胞的制备及重组质粒的转化PPT课件
-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；
❖经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发
生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。
experiments of molecular biology
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❖ 转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的 变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biolog1y
重组DNA技术
分：分离外源基因 目的基因。
切、接：利用酶学 方法，将外源基因 与载体连接，形成 复制子。
转：转化宿主细胞， 使复制子可以扩增 复制。
筛：筛选含有目的 基因的细胞(转化子) 并扩增以获得目的 基因克隆。
转化是微生物遗 传、分子遗传、基因 工程等研究的基本实 验技术。
experiments of molecular biology
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转化的方法
❖ 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试 剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克 处理将载体DNA分子导入受体细胞。
❖ 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受 态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子 导入受体细胞。
注
意
experiments of molecular biology
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思考题
1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？
2、如何利用抗性筛选出重组克隆？
experiments of molecular biology
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experiments of molecular biology
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接种于20 ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基 中,37℃振荡培养1-2小时至OD600 ＝0.5左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟， 然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。 2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4℃下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。 3、每50 ml初始培养物用200 µl预冷的0.1 mol/L 的CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟， 即成感受态细胞悬液。
【注意事项】
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 1、细胞生长状态和密度：最好从－70℃或-20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞 的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过 高或不足均会影响转化效率。
• 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细 菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体 细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂 法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Compenent cells)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体 细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生 物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本 实验技术。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形 成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面， 经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合 物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现 遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
• CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便 易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处 理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体） 共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青 霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转 化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的 受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化 子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、 酶切等进一步鉴定。
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 与转化
【实验目的】 • 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技
术。 • 学习大肠杆菌转化的原理与技术。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验原理】
• 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转 移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般 缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完 成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 5、将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上 清，用剩余的100μl上清重悬菌体，涂布于含Amp 的筛选平板上（已涂布IPTG 7µl和X-Gal 40 µl）， 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
• 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其 它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素 的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验步骤】
• 一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【设备、材料与试剂】
• 一、 设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机， 无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。
• 二、 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pUCmT质粒DNA: 购自上海生工生物工程有限公司。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺 陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的 突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内 并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛 选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离 心管中，置冰上。 2、加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置60分 钟。 3、42℃水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上 冷却2分钟。 4、向管中加入800 µl SOC液体培养基(不含Amp)， 混匀后37℃振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生 长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。（其间可以将IPTG 7µl和X-Gal 40 µl涂布 于预制Fra bibliotekAmp平板上）。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 附录：
• LB液体培养基：胰蛋白胨1％ 酵母提取物0.5％
NaCl 1％ 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。
• 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基
高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终 浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化