姓名：崔靖璞学号：2010212802 专业：生物科学
微生物多样性研究进展
摘要：微生物资源丰富,开发潜力巨大,是生命科学发展的主要动力之一.本文介绍了几种常用的研究微生物多样性的分子生物学技术,主要包括:16SrDNA测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等,并对微生物多样性研究技术的未来发展进行了展望，同时本文也介绍几种微生物多样性的研究实验方法。
关键词:微生物多样性聚合酶链式反应基因芯片平板纯培养
微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发,是21世纪生命科学发展的主要动力之一.由于微生物的微观性,微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处,包括:生存环境多样;生长、繁殖速度多样;营养、代谢类型多样;生活方式多样.微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的,研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量.近年来,随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等技术的发展,微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展.各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观.现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性.目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:16SrDNA 测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。
1核酸探针杂交技术
核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术.该技术快速、灵敏、具有高度特异性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中.用于微生物多样性研究的探针主要有三类:双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针,杂交方式主要有荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、全细胞杂交(whole-cell hybridization)、数量印迹杂交(quantitative dot blot)及生物芯片(biochip).对于环境微生物样品解析而言,最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术,在原位杂交技术中,应用最广泛的是荧光原位杂交技术。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是新兴的分子生物学技术,是在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术,是目前原位杂交技术中最常用的方法之一.FISH技术安全、简便、灵敏、快速,可同时检测几种微生物.Ramon Rossell-Mora,etal应用荧光原位杂交等技术对极端环境微生物群落多样性进行了研究.Kim,etal应用荧光原位杂交等技术对活性污泥中的硝化细菌进行了检测.Haruta,etal应用荧光原位杂交和双梯度变性凝胶电泳技术对有机固体废物处理过程中微生物多样性的变化进行了研究。
2 16SrDNA序列分析(16S rDNA sequencing)
16SrDNA为原核生物核糖体中一种大小约1500bp的核糖体DNA,因其分子大小适中、结构与功能上的高度保守性,有“分子时钟、黄金标准、细菌化石”之称.目前,16SrDNA基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究.Junge,etal 在应用16SrDNA序列分析北极冰细菌遗传多样性时发现,菌株aws-11B5(AF283859)与南极海冰嗜冷菌的相似性达到100%,认为在南北极同样也分布着相同的种.Phung,etal用16SrDNA序列分析法研究了贫瘠湖的微生物多样性,得到了许多不可培养的细菌.Fan,etal对古菌是否存在于分别取自中国的两个土壤及美国的两个土壤中进行了研究,构建了这四个16SrDNA文库并对28个克隆的16SrDNA进行了鉴定.所有这些16SrDNA的序列都归类于古菌的泉古菌门(Crenarchaeota)。分析表明,这些泉古菌的16SrDNA属于非高温陆地环境中的泉古菌种群,明显区别于海洋和淡水地带的泉古菌种群,证明泉古菌的存在范围不只局限于高温等极端环境.该方法的缺点是系统进化分析耗时且易受PCR偏差的影响.
3基因芯片技术
基因芯片是反相的斑点杂交,特异性探针以一定的方式被固定于某种介质上,在最后的扫描图像中探针以点的形式出现,每一个点代表一种特异性探针序列.基因芯片具有高通量、集成化、微型化、自动化、快速化的特点.Wu,etal建立了一种基因芯片的方法,用于检测细菌中氮循环有关的基因,其灵敏度为25ngDNA.Cal,letal建立了一种寡核苷酸芯片,该方法将免疫诱捕技术与PCR、基因芯片向结合,具有很高的灵敏度,对鸡肉中致病菌检测的灵敏度可达到低于102CFU/mL的水平.Smal,letal发明了一种基因芯片检测系统适用于直接检测土
壤细菌16srDNA。
4 基于PCR的基因指纹图谱技术
4.1 RFLP技术
RFLP是指16S rRNA基因的限制性片段长度多态性，它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。
原理：通过PCR扩增DNA，扩增产物经限制性内切酶消化，消化后的样品进行琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶电泳分析，用溴化乙锭或硝酸盐染色，有着核酸序列差异的不同种群微生物DNA其酶切片段的数量和大小不同，电泳图谱呈现多态性。
这种方法测定的序列数据库具有直接的参考意义，并且其测定的结果要比DGGE或者SSCP的结果更可靠。但是作图比较费时，难以分析大量的DNA样品，并且由于图谱的谱带比扩增DNA 的谱带要多，会过高估计群落成员数目。它产生的长多态性片段，含较多的等位基因，适用于鉴别种间的不同，当近缘种微生物在扩增片段靠近荧光标记端的切点时，该技术无法区分出这些近缘种。
4.2 T-RFLP技术
T-RFLP是指末端限制性片段长度多态性分析，与RFLP相似，只是在PCR 引物末端标记荧光。扩增基因由限制性酶降解，随后在自动DNA测序仪上检测，仅有那些荧光标记末端限制片段才可以被检测到。通过这些末端标记的片段就可以反映微生物群落组成情况.T-RFLP技术既可以进行微生物种类的定性分析,又可进行定量分析,比DGGE凝胶电泳有更高的灵敏度.但也存在定性信息不足的缺陷，并且因为片段不能回收，对群落进一步的鉴定是不可能的，而且价格也很昂贵。
4.3 DGGE技术
DGGE是指变性梯度凝胶电泳，该技术是由Fischer和Ler man于1979年最先提出的用于检测 DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyer等首次将DGGE 技术应用于微生物生态学研究,并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)
DGGE的工作原理：利用变性剂在聚丙烯酰胺凝胶中形成的浓度梯度，来分
