第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008
收稿日期:20080122。
基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。
作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405
土壤微生物群落多样性研究方法及进展
姚晓华
(广西大学农学院,广西南宁530005)
摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究
土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等)
和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进
行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面
地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。
关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A
中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A
Advancement of methods in studying soil microbial diversity
YAO Xiao -hua
(Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China)
Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1
Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA
微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1]
。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
1 土壤微生物群落多样性的概念
土壤微生物群落多样性,是指土壤微生物群落的种类和种间差异,微生物群落多样性包括物种多样性、遗传多样性及生理功能多样性等。物种多样性是群落中的微生物种群类型和数量,其中丰度和均度是多样性指数中的两个组成部分,也是多样性分析中最直观、最容易理解的要素。与高等生物相比,不同种群间的遗传物质和基因表达具有很大的差异,因此,微生物多样性在分子水平尤为突出。微生物有多种多样的代谢方式和生理功能,可以适应各种生态环境,并以不同生活方式与其他生物相互作用,这就表现出功能上的多样性。起初研究的重点在物种多样性和遗传多样性,随着各项技术的发展和研究角度的拓宽,功能多样性越来越受到重视。遗传多样性是物种多样性的基础,但又与物种多样性有区别,它揭示了不同类型的外界压力在物种演替过程中的遗传轨迹,除了微生物自身的遗传改变以外,环境影响及生态上的相互作用,也导致了功能的多样性。
2 土壤微生物群落结构的研究方法
典型的多样性研究是指在梯度压力或者其他生物、非生物因素影响下,种群的相对多样性。我们无法保证目前方法的精确性,所以利用现有技术很难研究真正的多样性。研究者试图把所搜集的信息降低为离散的、用数字表示的度量形式,比如多样性指数。目前研究土壤微生物多样性的方法可以分为两类:生化技术方法和分子生物学方法。
211 以生化技术为基础的研究微生物多样性的方法
21111 平板计数和形态学分析 传统的方法是利用选择性的平板来分离培养微生物,使用显微镜观察所分离的微生物,通过形态特征来确定微生物的种类,直接评估多样性。此方法快速、廉价,可以提供活的、异养类型的种群信息,特别是在水环境样品中,确实可以鉴定出许多种类。随着显微技术的不断提高,一些含有特殊荧光的微生物可以通过荧光显微镜来鉴定。如产甲烷微生物含F420辅助因子,在420nm 波长激发下产生绿色荧光,而鉴定含光合色素的微生物,如果与流式细胞仪结合使用,则可以对检测到的信息进行定量。To rsv ik 等[2]
利用DAPI (4,6-二胺基-2-苯基吲哚)染色,在
荧光显微镜下观察到1g 土壤中有412@1010个细胞,利用平板计数最多只能培养出412@106个菌落。
据估计,每克土壤中有上千个不同的种,大约100亿个微生物,但由于培养基和培养条件的限制,目前通过实验室人工培养方法已经被分离、描述的微生物种类和数量仅占估计数量的1%~5%,而其余95%~99%微生物种群仍然未被分离[3]。一些种类形态相似,仅凭显微镜无法准确判断,而有些微生物种类的形态特征相同,但是模式种已发生变异,故单凭形态学分析已不能把它们分开。因此,采用培养和形态鉴别的方法用于微生物多样性的研究,不可避免地会低估了多样性的丰富度。21112 群落水平单碳源利用模式(CLPP) Garland 等[4]首次利用96孔微量板,通过单一碳源利用能力(SCSU)来评价细菌群落的功能多样性。目前该方法已经广泛应用于评价污染物对微生物群
落及其代谢功能影响的研究中。国内杨永华等[5]用CLPP 方法对农药污染土壤中的微生物群落进行了
研究,测定结果显示,污染土壤的Shannon 指数和均度、Simpson 指数、M cIntosh 指数和均度均明显低于无污染的土壤。这表明,农药污染导致了土壤中微生物代谢功能多样性的下降,同时也导致了微生物种类的减少。
由于这种方法只选择了在试验条件下可培养的、快速生长的微生物,所以从严格意义上来说,只反应了潜在的而不是原位的代谢多样性[4]。例如,一个并不活跃或者只代表了原位群落中小部分的集团,可以在Biolo gy 孔中处于竞争优势,这就使我们错估了这些集团在原位群落中的地位。此外,Biolo gy 孔中所包括的碳源并不能完全代表土壤中的碳源。因此,仅利用Biolog y 信息得到的关于微生物多样性的结论受到很多人的置疑。然而,毫无疑问的是,如果这种方法和其他方法联合起来研究微生物多样性,将是非常有用的工具。
21113 脂肪酸甲酯(FAME)/磷脂脂肪酸甲酯法(PLFA)分析法 生物不仅在形态上有区别,更重要的是在结构上也明显不同。采用生物标记分子作为鉴定微生物种群的决定因子,可减少使用显微85增刊 姚晓华等:土壤微生物群落多样性研究方法及进展
