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密度梯度离心法名词解释密度梯度离心法，简称DGGE，是分子生物学中常用的一种分析DNA序列变异、基因分型、菌群多样性等的方法。
这种方法以PCR扩增的DNA片段作为目标，通过DGGE电泳技术将不同样品的DNA条带分离，进而分析不同样品中的DNA变异、基因型或者菌群结构。
DGGE原理基于DNA的双链分子在电场作用下会断裂成单链，然后是交替出现的分子器极吸附和交错序列的碱基浸润作用，最终排序各种DNA片段。
DGGE和传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，是基于DNA 片段移动到含有梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳板表面或者介质中（如聚合物链等）的不同位置，从而实现不同样品中 DNA 片段的分离。
因为在含有不同梯度的聚丙烯酰胺凝胶中，DNA片段会在某种梯度电场下保留在特定区域，形成明显的DNA 条带，样品与样品之间差异不大的DNA 条带在聚丙烯酰胺凝胶板上合并形成了带状图。
这些线条被称为DNA条带，代表了DGGE样本中的每个扩增片段。
DGGE方法最大的优点在于它可以等比例、标准化地比较基因片段的有无、变异类型和程度等信息，而且对于那些较短的DNA 片段而言，它在分析能力方面要高于Sanger定序。
DGGE的应用逐渐从基因型分析扩大到生态学及其它应用，比如在菌群生态学、变异鉴定、致病菌及病毒检测、种群学研究以及气叶互作与林木营养学研究等领域有广泛的应用。
总之，DGGE的主要特点在于其高效性、快速性和准确性，成为分子生物学和生态学分析技术的重要手段之一，其在微生物层面的应用更是颇有潜力。
同时，由于其对于样本的提纯和扩增要求较高，还需在实验上精益求精。
DGGE方法的优点、实验步骤和要求、应用场景等方面，建议科研学者进行深入研究和探索，为其在不同社会和环境背景下的发展做出更多的贡献。
高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价一、本文概述随着生物技术的发展和深入，土壤微生物群落的研究逐渐受到广泛关注。
作为土壤生态系统的重要组成部分，微生物群落的结构和多样性对土壤健康、生态平衡以及农业可持续发展具有重要影响。
高通量测序技术和DGGE（变性梯度凝胶电泳）分析是近年来在微生物生态学研究中常用的两种技术手段，它们各自具有独特的优势和局限性。
本文旨在全面评价这两种技术在土壤微生物群落研究中的应用效果，以期为相关领域的研究提供有益的参考和借鉴。
本文首先将对高通量测序技术和DGGE分析的基本原理、操作流程及其在土壤微生物群落研究中的应用进行详细介绍。
随后，通过综述已有文献和案例分析，评估这两种技术在揭示土壤微生物群落结构、多样性和动态变化方面的准确性和可靠性。
本文还将探讨这两种技术在实践应用中的优缺点、适用范围及限制条件，以期为研究者在选择合适的技术手段时提供有益的指导。
本文旨在通过深入评价高通量测序和DGGE分析在土壤微生物群落研究中的应用效果，为相关领域的研究提供有价值的参考信息，推动土壤微生物生态学研究的深入发展。
二、高通量测序技术及其在土壤微生物群落分析中的应用高通量测序技术，又被称为下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS），是近年来生物学领域革命性的技术进步之一。
它允许在单次运行中同时对数百万至数十亿的DNA分子进行测序，极大地提高了测序通量和效率。
在土壤微生物群落分析中，高通量测序技术已成为不可或缺的工具。
高通量测序技术基于边合成边测序的原理，通过桥式PCR扩增生成DNA簇，并利用可逆性终止子的荧光标记核苷酸进行连续测序。
在测序过程中，每加入一种荧光标记的核苷酸，都会通过扫描记录下荧光信号，并切除荧光基团和终止基团，继续进行下一个核苷酸的添加和测序。
这一过程循环进行，直至获得完整的DNA序列信息。
土壤是一个极为复杂的生态系统，其中包含了大量的微生物种类和种群。
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
PCR -DGGE 技术及其在微生物生态学中的应用张宝涛1,王立群13,伍宁丰2,石鹏君3(1.东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030;2.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;3.中国农业科学院饲料研究所,北京100081)摘要:现代分子生物学技术PCR -DGGE 是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究生态系统中微生物多样性和群落动态性。
本文简要介绍了PCR -DGGE 技术原理及其在微生物生态学领域的应用,并对该技术的局限性进行了评价。
关键词:PCR -DGGE ,微生物生态学,现代分子生物学技术,微生物多样性,微生物群落动态性中图分类号:Q93811 文献标识码:A 文章编号:1672-5565(2006)-03-132-04收稿日期:2005-10-24;修回日期:2005-10-29作者简介:张宝涛(1980-),男,山东人,硕士研究生,主要从事环境微生物和应用微生物的研究.E -mail :jonbob @ 3通讯作者:王立群,男,黑龙江省人,教授,主要从事应用微生物学研究。
E -mail :W angliqun2@Application of PCR -D GGE in microbial ecologyZH ANG Bao -tao 1,W ANGLi -qun13,W U Ning -feng 2,SHI Peng -jun3(1.College o f life science ,Northeast Agricultural univer sity ,Harbin 150030China ;2.Biotechnology Research Institute Chinese Academy o f agricultural Sciences.Beijing 100081China ;3.Feed Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract :As a m odern m olecular technology ,PCR -DGGE is a power ful tool for the analysis of microbial communities ,which can be used to study the diversity and dynamics of microbial communities.The principle and the application of PCR -DGGE in microbial ecology is briefly in 2troduced ,while the limitations of this technique are evaluated in this paper.K ey Words :PCR -DGGE ;microbial ecology ;m odern m olecular technology 在微生物生态研究中,准确地分析测定微生物群体的类型和数量是非常重要的,因为微生物个体微小,结构简单,缺乏明显的外部特征,且难以依据生理生化特征进行分类鉴定。
微生物学通报 JAN 20, 2010, 37(1): 147−154 Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAStongbao@*通讯作者：Tel: 86-23-68251088; : zyzhou@ 收稿日期：2009-08-29; 接受日期：2009-11-11生物实验室PCR-DGGE 研究微生物种群中多条带产生原因分析陈章宝1 向少能1 江震献1 周泽扬1,2*(1. 西南大学蚕学与系统生物学研究所微生物分室 重庆 400716)(2. 重庆师范大学生命科学学院 重庆 400047)摘 要: 鸡肠道微生物菌群经PCR-DGGE 分析, 回收PCR-DGGE 分析胶上的一条DNA 片段, 回收的DNA 片段再重复进行2次PCR-DGGE 分析, 以及分别用PCR 反复循环扩增和PCR 高保真酶扩增后再进行DGGE 分析等方法研究PCR-DGGE 分析中多条带产生原因。
结果显示PCR-DGGE 分析中多条带产生原因可能是作PCR 扩增模板的DNA 混杂有少量其他DNA 片段, 多条带现象不易被消除。
DGGE 分析胶上的DNA 片段测序时, 将该DNA 片段回收、PCR 扩增后克隆, 提取多个阳性克隆菌的质粒DNA 片段, 分别与其原目的DNA 片段进行DGGE 分析, 在DGGE 分析胶上选取与原目的DNA 片段处于同一电泳位置的质粒DNA 测序, 提高测序的准确性。
关键词: PCR-DGGE 技术, 多条带, 原因分析, 微生物种群Analysis on Causes of Multi-bands in Researchingon Microbe Populations by PCR-DGGECHEN Zhang-Bao 1 XIANG Shao-Neng 1 JIANG Zhen-Xian 1 ZHOU Ze-Yang 1,2*(1. Microbiology Division , Institute of Sericulture and Systems Biology , Key Sericultural Laboratory ofAgricultural Ministry , Southwest University , Chongqing 400716, China)(2. Chongqing Normal University , Chongqing 400047, China )Abstract: Microbe populations from chicken intestinal were analyzed by PCR-DGGE. DNA fragment rep-resented by a band from DGGE gel was retrieved. DNA fragment was two times repeated analyzed with PCR-DGGE, furthermore PCR reamplification and using high-fidelity DNA polymerase amplification also be applied to study on causes of multi-bands in PCR-DGGE analysis. The results showed that the causes of multi-bands in PCR-DGGE analysis may be that DNA templates for PCR mixed with other DNA fragment, and it was difficult to eliminate phenomenon of multi-bands in PCR-DGGE analysis. While the DNA frag-ments represented by bands from DGGE gel was sequenced, cloned this DNA fragments and extracted plasmid DNA of positive bacteria, and the plasmid DNA was amplified and analyzed again on DGGE gel to verify its position. Colonies whose positions were the same with the original DNA were selected for DNA sequencing to improve the veracity of DNA sequencing.148微生物学通报2010, Vol.37, No.1/wswxtbcnKeywords: PCR-DGGE technology, Multi-bands, Analysis on causes, Microbe populations.变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)最初是由Fischer 和Lerman 于1979年最早提出的用于检测DNA 片段中单个碱基改变的点突变的一种电泳技术[1]。
PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中的应用PCR-DGGE法（Polymerase Chain Reaction-Denaturing GradientGel Electrophoresis）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于微生物多样性研究中。
该方法结合了PCR和DGGE两种技术，能够高效地研究水体中微生物的多样性。
在水体环境中，微生物多样性的研究对于了解水体生态系统的结构、功能和风险评估具有重要意义。
传统的经营学方法主要依靠培养方法，存在着无法培养、无法鉴定、样本处理繁琐等问题。
而PCR-DGGE法能够通过直接分析环境中的微生物DNA来研究微生物多样性，具有不依赖培养方法、快速高效、准确性强等优点，成为研究水体微生物多样性的重要工具。
PCR-DGGE法的基本思路是通过PCR扩增目标基因片段，然后将扩增产物在含有梯度浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。
梯度浓度可以是通过改变聚丙烯酰胺中脱氧核糖核酸（DNA）链脱离温度（解聚形成的PCR产物）或通过改变变性剂（封闭螺旋形成缺失DNA链）而形成的。
由于序列不同的DNA分子在不同的电泳条件下迁移速度不同，所以可以通过分析DGGE图谱来了解样品中微生物群落的组成和多样性。
PCR-DGGE法广泛应用于水体微生物多样性研究中。
一方面，该方法能够直接检测水体中的微生物DNA，避免了无法培养的问题，使研究更加准确和全面。
另一方面，PCR-DGGE法具有高通量分析能力，可以同时研究多个样品，提高研究效率。
此外，PCR-DGGE法还可以通过改变PCR反应中的引物和扩增条件，选择不同的目标基因片段，从而研究不同层次的微生物多样性，如细菌、真菌等。
在具体应用中，PCR-DGGE法可以用于研究水体中微生物群落的空间和时间分布。
通过采集不同地点或不同时期的水样，提取DNA并进行PCR-DGGE分析，可以了解不同环境条件下微生物多样性的差异。
例如，可以研究不同水深、不同温度、不同盐度等因素对微生物群落结构的影响。
变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。
DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。
实验流程图：实验结果实验结果包括以下内容1 引物设计以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。
引物序列（5’-3’）细菌 16S V3区扩增引物357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG518r ATTACCGCGGCTGCTGG引物 序列（5’-3’）真核 18S V1-3区扩增引物Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAGEukA516r-GCCGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC2 基因组DNA 抽提电泳检测图针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。
说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。
3 目的片段PCR 检测说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。
其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。
Reconditioning PCR：第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。
由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。
参考文献：(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博士学位论文.4 DGGE图谱分析4.1 DGGE胶图和条形图4.2 戴斯相似性系数4.3微生物多样性指数4.4 UPGAM法进行样品间的聚类分析图常见聚类分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s4.5微生物群落的多维定标分析4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）5 主要胶条进行割胶6 割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆6.1 二扩电泳检测分别取5 μL PCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。
6.2 胶回收采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物，取3 μL回收产物进行电泳检测。
6.3 TA连接及转化PCR产物的克隆使用 BioLinker的pED-T载体试剂盒。
6.4 阳性克隆的筛选及测序在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。
7 测序结果汇总7.1 fasta文件全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后续分析做准备。
7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。
如下图所示：7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表条带克隆子菌株名称GenBank序最大相似条带占比编号编号 列号 度（%） （%）1 3 Winogradskyella ulvae strain KMM 6390NR_109172.1 91 67 7Polaribacter irgensii strain 23-PNR_044733.1 99 33 2 4 Cyanothece sp. ATCC 51142 strain ATCC 51142NR_074316.1 93 33 5 Clostridium populeti strain 743ANR_026103.1 99 33 7Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1062 strainHTCC1062NR_074224.1100333 3 Paraprevotella clara YIT 11840 NR_041626.1 100 67 8Flavobacterium limicola strain ST-82 NR_024787.1 97 33 4 1Bacteroides vulgatus ATCC 8482 strain ATCC8482NR_074515.11001005 1 Bacteroides fragilis YCH46 strain YCH46 NR_074839.1 99 100 6 1 Bacteroides gallinarum strain JCM 13658 NR_041448.1 98 100 71Megamonas rupellensis strain FM1025NR_044473.1971007.4测序结果的系统发育树分析DGGE 技术的优缺点优点：1. 高效，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。
2. 方便，不用对样品进行标记3. 快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱4. 直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度5. 稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高6. 可多样本同时分析，展现各样本的差异缺点：1. 仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。
2. DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。
3. 因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。
4. 不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段5. 因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。
6. DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。
7. 由于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。
送样要求1 、环境样品基因组DNA1） 请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。
如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。
2） 样品在保存期间避免反复冻融。
3） 送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。
4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
2、环境样品1）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。
2）样品在保存期间避免反复冻融。
3）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应抑制剂，请在送样时注明。
4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
送样条件：以上两种类型的样本，送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。
3、各类未抽提基因组样品的送样量：土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）粪便：3-5 g肠道内容物：3-5 g动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。
血液：10mL。
叶片：50-100g其他来源的样品请垂询。
以上用PP材料的epp管或螺口管盛装即可。
