PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题

辣根过氧化物酶活性检测方法研究张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【期刊名称】《广州城市职业学院学报》【年(卷),期】2017(011)003【摘要】通过单因素实验和正交实验研究了辣根过氧化酶(HRP)活性测定条件:缓冲溶液种类、缓冲溶液离子浓度、pH值、温度对其影响.实验结果表明在25℃下,0.1mol/L,pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中反应,辣根过氧化物酶的酶活力达到最大值1.13×107 U/g;确定辣根过氧化物酶活性的最佳检测方法:1mg HRP溶解于1mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0),反应温度为25℃,检测波长为436nm.该方法简单可靠,操作简便,可有效应用于实验室和常规生化检测.【总页数】4页(P73-76)【作者】张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【作者单位】广州城市职业学院食品系,广东广州510405;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;深圳市计量质量检测研究院,广东深圳518055【正文语种】中文【中图分类】O657.32【相关文献】1.催化分光光度法测定辣根过氧化物酶新方法研究 [J], 魏永锋;阎宏涛2.基于多指标抗炎活性检测的注射用血塞通生物评价方法研究 [J], 马湘炜;蒋淑敏;赵筱萍3.季胺-辣根过氧化物酶-过氧化氢显色新体系及其在酶活性检测中的应用 [J], 李建国;刘颖;鞠熀先4.基于表面增强拉曼光谱的碱性磷酸酶活性检测方法研究 [J], 江蕾; 甘振飞; 陈华英; 常帅; 李家宾; 李大伟5.基于Ce-BDC的氧化物酶活性检测果汁中抗坏血酸的比色方法研究 [J], 杨阳;刘光勤;杨思龙;艾雪莲;梁秋红;罗林频;汪蓉;王建龙;张文涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

辣根过氧化物酶标记抗体原理一、辣根过氧化物酶标记抗体的原理辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用的酶标记物，具有很高的灵敏度和稳定性。

辣根过氧化物酶标记抗体原理主要是利用辣根过氧化物酶与抗体的特异性结合，通过其催化能力来检测目标分子的存在并定量分析。

辣根过氧化物酶标记抗体的制备过程主要分为两个步骤：辣根过氧化物酶的活化和抗体的标记。

1. 辣根过氧化物酶的活化辣根过氧化物酶通常以干燥粉末的形式存在，需要在一定条件下进行活化。

活化的过程中，辣根过氧化物酶会与过氧化氢发生反应，形成活性中间体。

这个活性中间体具有较强的催化能力，可以催化底物的氧化反应。

2. 抗体的标记在活化的辣根过氧化物酶中，将目标抗体与其特异性结合。

这个过程中，通常使用交联剂来进行共价结合，使得辣根过氧化物酶与抗体牢固地结合在一起。

这样就得到了辣根过氧化物酶标记抗体。

二、辣根过氧化物酶标记抗体的应用辣根过氧化物酶标记抗体在生命科学研究中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 免疫组化辣根过氧化物酶标记抗体可以用于免疫组化实验，通过与目标抗原的特异性结合，可以在组织切片中精确地定位抗原的存在位置。

辣根过氧化物酶的催化反应会产生可见的颜色，从而可以直观地观察到抗原的分布情况。

2. 免疫印迹辣根过氧化物酶标记抗体也可以用于免疫印迹实验，通过与目标蛋白的结合，可以检测目标蛋白的存在和表达水平。

辣根过氧化物酶的催化反应会产生发光信号或者颜色变化，从而可以定量地测量目标蛋白的数量。

3. 免疫荧光辣根过氧化物酶标记抗体还可以用于免疫荧光实验，通过与目标抗原的结合，可以在细胞或组织中观察到荧光信号。

这种方法可以用来研究细胞的定位、蛋白的相互作用等重要生物学过程。

4. 免疫流式细胞术辣根过氧化物酶标记抗体也可以应用于免疫流式细胞术，通过与目标抗原的结合，可以实现对细胞表面抗原的定量和检测。

通过流式细胞仪的高通量检测，可以同时分析大量细胞的抗原表达情况，为研究细胞免疫学提供了重要手段。

辣根过氧化酶的表达和酶活性测定辣根(Garden radish)是一种食用根菜，辣根中含有大量的过氧化酶(peroxidase)，这种酶可以催化物质的氧化还原反应，具有重要的生物学意义和应用价值。

本文将介绍辣根过氧化酶的表达和酶活性测定。

一、植物基因工程的原理和方法植物基因工程是将外源基因导入植物体内，使其表达所需的蛋白质，以达到改良植物性状和提高产量等目的。

主要方法包括以下几个步骤：1.选择载体：通常采用质粒作为载体，其优点是易于操作、成功率高、适用于多种植物等；缺点是获得的转基因植物往往存在多个拷贝数、位置不固定等问题。

2.克隆外源基因：从外源来源中克隆所需要的基因，通常采用PCR或酶切法进行操作。

3.构建基因转化载体：将外源基因与载体进行连接，构建基因转化载体。

4.基因转化：将构建好的基因转化载体通过农杆菌或基因枪等方法导入植物细胞，使其被转化。

经过选育和筛选后，可以选择对应的转化植株进行表达和性状分析。

二、辣根过氧化酶的表达过氧化酶是一种重要的生物催化剂，广泛存在于植物、动物和微生物等生物体内。

辣根中的过氧化酶具有比较高的催化活性，因此对于其表达成为了许多研究的重要方向。

下面就介绍几种常用的表达方法。

1. 转基因植物表达法通过外源基因的转入，使植物细胞内部合成所需的蛋白质。

相比细胞培养和分离提取等方式，这种方法更具有稳定性和可控性。

2. 细胞培养和分离提取法采用感光荧光素光反应，测定培养细胞或组织提取物中的过氧化物酶活性，以此测定过氧化酶的表达。

3. 重组工程菌表达法将辣根过氧化酶基因克隆到大肠杆菌等可表达目的蛋白质的菌株中，使其高效表达，从而为进行治疗和检测等方面提供重要基础。

三、辣根过氧化酶的酶活性测定方法1. 常规方法-光度法光度法是一种基于酶催化产物的吸光度变化的测定方法。

常用的基质是苯酚，产生硫酸化产物。

方法简单，测量结果准确，但是缺点是需要消耗大量的试剂和设备。

此外，在测定过程中也可能出现误差。

辣根过氧化物酶示踪电泳法是一种常用的分离和检测生物大分子的方法，在分子生物学、生物化学和医学等领域被广泛应用。

本文将从简单介绍辣根过氧化物酶示踪电泳法的原理和应用，逐渐深入探讨其在研究和诊断中的重要性和潜力。

一、基本原理和技术实施辣根过氧化物酶（HRP）是一种常见的内源性酶，具有较高的催化活性和稳定性。

它能与生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）发生特异性结合，并通过催化染色反应产生可观测的颜色或荧光信号。

辣根过氧化物酶示踪电泳法利用这种酶的特性，结合电泳技术，实现对生物大分子的分离和检测。

在实验中，首先将样品经过适当的处理和纯化，使其具备较好的电泳性质。

将样品加在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，施加电场后，生物大分子根据其大小、电荷等特性在凝胶中进行迁移。

随后，在凝胶上均匀涂敷含有辣根过氧化物酶底物的试剂液，使其与迁移的生物大分子相互作用。

通过合适的显色或荧光检测方法，观察样品中的目标分子的分离和定量分析。

二、应用领域和意义辣根过氧化物酶示踪电泳法在研究和诊断中具有广泛的应用。

以下列举几个典型的应用领域和意义：1.基因组学研究：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测基因组DNA中的特定序列。

通过其高灵敏度和特异性，可以快速鉴定目标基因、分析基因的结构和功能，并深入研究基因组的变异和表达情况。

2.蛋白质组学研究：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测蛋白质混合物中的目标蛋白质。

结合其他分离和鉴定技术，可以揭示蛋白质的功能、相互作用和调控机制，为疾病诊断和药物研发提供重要的信息。

3.临床诊断：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测体液中的特定分子标志物，如肿瘤标志物、病毒RNA等。

通过对这些标志物的分离和定量，可以实现早期诊断和疾病监测，为临床治疗提供准确和可靠的依据。

4.食品安全检测：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测食品中的有害物质或添加剂残留。

毒素、重金属、防腐剂等对人体健康具有潜在危害的物质可以通过该方法快速鉴定和定量，保障食品安全和公众健康。

辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化隐性亮绿显色反应的研究
辣根过氧化物酶（Peroxidase）在体外可以催化过氧化氢（H2O2）氧化隐性亮绿（Hidden bright green, HgG）显色反应，并且研究证明辣根过氧化物酶具有高度稳定性和高度抗多肽特异性。

作为一种“酶试剂”，它能有效抑制体外反应，具有抗氧化特性和低致敏性，使过氧化氢反应的体外应用更为广泛。

辣根过氧化物酶可以完整保持其氢和氧化物过渡态，这就给它的应用提供了可靠的保证。

它的分子量在67~74 kD之间，可以高度特异性地与多种人体肽激酶和细胞色素酶（cytochrome P-450）类物质结合，使它在生理机制中具有调节作用。

它以修饰某种肽激酶和细胞色素酶，促进发育和代谢，以及耐热和耐药性等方面发挥作用，这为药物的发展提供了新的可能性。

辣根过氧化物酶可以与各类大分子物质进行反应，通过两氧化氢（H2O2）氧化隐性亮绿（HgG）显色反应（检测多肽物质），用于鉴别和检测活性多肽，对活性多肽的检测具有重要意义。

而且，辣根过氧化物酶有助于增加体外反应效率，降低污染物积累，减少反应液体量以及反应器容量，从而使其在生物技术和医药生产中具有重要意义。

总之，辣根过氧化物酶在体外的应用效果显著，它具有高度稳定性、免疫原性和耐受度优异的特点，可用于定量检测活性多肽，研究也表明辣根过氧化物酶在长期的研究和应用中，具有重要的意义。

因此辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化隐性亮绿显色反应，在各个领域和领域中都具有不可替代的价值。

过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶活性的测定(比色法)过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

二、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料:马铃薯块茎。

(二)试剂1 ( 100 mmol , L 磷酸缓冲液 pH7.0 (见附录)。

磷酸氢二钠。

磷酸二氢钠。

2 (反应混合液: 100 mmol , L 磷酸缓冲液( pH7.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚((邻甲氧基苯酚) 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

(三)仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。

三、实验步骤1 (称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r , min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 (取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之)，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ] 表示之。

也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。

过氧化物酶显色
过氧化物酶显色是一种常见的生物学实验技术，它利用过氧化物酶催
化底物产生颜色反应，从而实现对样品中过氧化物酶活性的定量分析。

下面，我将从原理、实验步骤、应用等方面介绍这种技术。

一、原理
过氧化物酶显色技术的主要原理是利用底物发生氧化还原反应，从而
产生可见光吸收，实现对过氧化物酶活性的定量分析。

过氧化物酶催
化底物如TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）在存在过氧化氢（H2O2）的情况下，底物发生氧化反应，生成过氧化物，过氧化物再将底物氧化产生高分子产物，在酸性环境中产生深蓝色或棕色沉淀，
可通过比色法分析结果。

二、实验步骤
1. 准备样品：将待测样品加入显色液中，显色液的具体组成根据样品
的性质而定。

注意：样品中不要含有过氧化氢，否则会干扰结果。

2. 添加底物：加入TMB底物。

3. 加入过氧化氢：加入H2O2。

4. 活化催化剂：等待5-10分钟，让催化剂活化。

5. 加入停止液：加入酸性停止液，停止反应。

6. 分析结果：通过分析样品颜色深浅或光密度值，计算出样品中过氧化物酶的活性。

三、应用
过氧化物酶显色技术被广泛应用于各种生物学、医学领域中。

例如，利用过氧化物酶显色技术可以进行酶动力学研究、检测样品中过氧化物酶的活性、检测生物体内一氧化氮的浓度等。

此外，它还可以应用于药物筛选、抗氧化剂研究等。

总之，过氧化物酶显色技术具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点，是一种常用的生物学实验技术。

它的应用领域广泛，对于生物学和医学领域的研究和工作有着重要的意义。

辣根过氧化物酶显色原理
辣根过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种植物存在的类固醇调节的酶，广泛存在于植物细胞中。

辣根过氧化酶有着独特的特性，可以在低温和低pH环境下保持稳定，具有高活性，可以用于检测和分析，是一种重要的工业应用酶。

辣根过氧化物酶的显色原理是，它可以将过氧化物与细胞膜上的特定色素结合，从而产生一种特定的色彩。

辣根过氧化酶显色原理的概述如下：
1、辣根过氧化物酶可以与过氧化物结合，同时在细胞膜上形成一种特定的色素。

2、过氧化物与辣根过氧化酶形成的特定色素具有某种特定的光谱特性，当这种特定的色素与一定波长的光谱相互作用时，就会发生发射现象，形成一定的色彩。

3、辣根过氧化物酶与特定色素之间的反应可以调节，以达到检测和分析的目的。

辣根过氧化酶显色原理的实际应用可以运用到生物技术领域，如在生物技术的检测中，可以使用辣根过氧化酶显色原理，通过调节过氧化物与辣根过氧化酶之间的反应，检测特定物质的含量，从而达到检测和分析的目的。

此外，辣根过氧化物酶显色原理可以用于食品安全检测，在食品安全检测中，可以使用辣根过氧化酶显色原理，通过调节过氧化物与辣根过氧化酶之间的反应，检测是否存在有害物质，及其含量，从而保证食品安全。

因此，辣根过氧化物酶显色原理的应用可以得到广泛的应用，它可以用于生物技术的检测，也可以用于食品安全检测，确保食品中没有有害物质，从而保证人们的健康。

辣根过氧化物酶显色原理的发展，将为医学检测、食品检测、环境检测等提供更为准确、快速、灵敏的检测方法，让人们拥有一个更加安全、健康的生活和环境。

DAB显色试剂盒（20×）说明书货号：DA1010规格：DA1010-3DA1010-10溶液A3ml10ml溶液B3ml10ml保存：-20℃避光密闭保存，一年有效，避免反复冻融；短期可2-8℃保存。

产品简介：DAB是过氧化物酶（POD）的显色底物，DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法，适用于辣根过氧化物酶HRP标记的免疫印记或免疫组化反应。

过氧化物酶催化底物发生反应，于反应部位产生棕色沉淀物，免疫印记可直接在膜上显示条带；免疫组化标本显色时间一般为室温5-20分钟，随后在显微镜下观察显色情况，显色充分后应将标本及时脱水封固，其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。

操作说明：1.对于组织切片或蛋白质印记膜，在与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。

2.取900μl PBS（或双蒸水），加入50μl溶液A，50μl溶液B混合均匀，即配成DAB工作液。

如需要更大体积工作液，可按比例放大。

此溶液必须现用现配，配好后避光保存，1小时内使用，过期后请将剩余的液体废弃。

3.向组织切片或印记膜上加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。

4.室温避光孵育3-10分钟或更长时间，避免光照，直至显色至预期深浅。

5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤2-3次即可终止显色反应。

6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可对其进行其他染料复染。

对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

注意事项：1.DAB溶液应低温密封保存。

如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。

2.显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用。

3.显色时间严格控制，根据情况调整，以免显色过度。

固相膜显色数小时后即会褪色，不能永久存在。

4.DAB为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。

操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。

产品说明书 / Specification Sheet辣根过氧化氢酶DAB显色试剂盒产品编号：PW017产品简介：DAB即：二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。

用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。

是HRP结合物最常用的底物,常在免疫组化,原位杂交,Western blot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。

运输和保存条件：常温下运输，收到后，将溶液A, 溶液C在-20度闭光的环境中保存，反应液2-8度保存，保质期一年。

组成:本试剂是为免疫组化,原位杂交,Western blot等膜显色专门配制的,由反应液,溶液A, 溶液C三部分构成:能够使用5次1: PW017-1 反应液50ml2:PW017-2 溶液A 1 ml3:PW017-3 溶液C 0.12ml使用方法:1:在免疫印迹(western blot)实验中,先将相应的HRP（辣根过氧化氢酶）标记的二抗覆盖膜后,在37度的情况下,于震荡器上,震荡一个半小时左右,再用TBST或者PBST洗涤膜3~4次,最后一次用TBS或PBS洗涤膜,再将膜转移到阴暗处。

2:显色前,先取反应液10 ml在一个15ml的干净棕色瓶子中，再取200ul左右的溶液A和溶液C 20ul形成显色工作液, 加入充分混匀。

3在阴暗处.将显色工作液加入膜上,将膜覆盖, 在37度的情况下,震荡反应十分钟左右即可.这时浅棕色的条带出现。

4倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3~4次，自然干燥。

5照像记录实验结果。

注意事项:1: 溶液A在使用之前，37度温育10分钟，以免产生沉淀。

2: 显色时间严格控制，非常小心，一般10分钟左右。

以免造成过度显色，而且显色后数小时将会褪色。

3: 请使用完后，将反应液，溶液A, 溶液C的盖子旋紧,以防止溶液挥发和与空气中的成分发生化学反应。

仅供科研版本号：161208 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×)【产品组成】【保存条件】-20℃,避光,12个月【产品概述】DAB辣根过氧化物酶显色液(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。

DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。

在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。

因此在DAB显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。

本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。

同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。

【使用方法】1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

2、按(A):试剂(B):蒸馏水=1:1:18的比例混合,即为DAB染色工作液，即配即用。

3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保覆盖样品。

4、室温避光孵育30min或更长时间，直至显色至预期深浅。

5、去除DAB染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。

6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。

对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。

【常见问题及可能原因】1、背景显色太深①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。

过氧化物酶检测试剂盒使用说明货号：BC0090规格：50管/48样产品简介：POD广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL试剂一，现配现用；试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200w，超声3秒，间隔10秒。

重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、POD测定操作表试剂名称（μL）测定管试剂一520试剂二130试剂三135蒸馏水270样本15测定前将试剂一、二和三37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min。

在1mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，加入样本后立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。

计算ΔA=A2-A1注意：如果ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5min。

如果ΔA大于0.5，可将样本提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数POD活性计算：1、血清（浆）POD活力的计算:单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟使A470变化0.01定义为一个酶活力单位。

POD（U/L）＝反应总体积（1070ul）÷样本体积（15ul）÷0.01×ΔA=7133×ΔA2、组织POD活力计算：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟使A470变化0.01定义为一个酶活力单位。

辣根过氧化物酶标记凝聚素的组织化学染色程序
辣根过氧化物酶标记凝聚素的组织化学染色程序
1．组织切片脱蜡处理等同前；
2．流水冲洗5分钟，3％H2O2孵育10分钟(阻断内源性过氧化物酶，避免假阳性)；
3．漂洗3次，每次5分钟；
4．1％牛血清白蛋白孵育，室温20分钟，移去多余液体；
5．加入稀释的辣根过氧化物酶—凝集素，置湿盒内孵育。

室温1．5小时；
6．漂洗3次．每次5分钟；
7．呈色 DAB液(配制：DAB 5mg，pH 7．6 Tris—HCl 10ml，3％H2O2 40ul)室温暗处10—15分钟；
8．蒸馏水洗5分钟，流水短暂冲洗后，常规乙醇脱水，二甲苯透明，封片；
9．光镜观察?阳性反应部位呈棕褐色。

10．注意事项
(1)为防止染色过程中切片脱落，载玻片可用铬矾/明胶或赖氨酸等黏片剂处理；
(2)脱水时与普通石蜡切片不同，70％乙醇时间不宜太长，以免阳性反应褪色；
(3)辣根过氧化物酶—凝集素的最佳工作浓度亦需经预实验确定；
(4)H2O2对碳水化合物有一定影响，可能改变凝集素的结合情况，但影响不显著。

DAB显色试剂盒
Data sheet: 40412a
Cat.No:DAB-0031/1031
前言
本试剂盒适用于辣根过氧化酶(HRP)系统的免疫组化染色，如PAP、ABC和SP法等。

试剂盒组成
试剂A: DAB缓冲液(DAB Buffer，20×) 3 ml/ 12 ml 试剂B: DAB底物 (DAB Substrate，20×) 3 ml/ 12 ml 试剂C: DAB显色剂(DAB Chromogen，20×) 3 ml/ 12 ml 使用方法
在小试管中先加入0.85ml蒸馏水，再按试剂A、B、C顺序加入试剂各50μl，混匀即成1ml的DAB显色液。

若出现沉淀可过滤后使用。

配制好的溶液应避光存放，30分钟内有效。

染色结果为棕色。

室温下染色时间约3-10分钟，一般在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。

试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml (600片)/ 12ml (2400片)
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1年
注意事项
本试剂盒仅适合研究使用。

在使用过程中，请勿将试剂沾染到皮肤或衣物上。

辣根过氧化物酶及其使用介绍酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。

酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。

酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。

酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。

目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。

高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。

在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。

但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。

HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。

酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。

HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。

高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。

RZ值越小，非酶蛋白就越多。

值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。

供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

过氧化物酶染色液（DAB法）使用说明书过氧化物酶染色液(DAB法)使用说明书货号：G2370有效期：6个月有效。

产品内容：名称4×10ml4×20ml Storage 试剂(A):BFA固定液10ml20ml4℃避光试剂(B): POX孵育液B1:DAB染色液10ml20ml-20℃避光B2:DAB氧化剂2×100μl4×100μl RT临用前，按B1:B2=1000:1比例混合，即为POX孵育液，即配即用。

试剂(C):WG染色液10ml20ml RT避光试剂(D):WG buffer10ml20ml RT产品说明：过氧化物酶(Peroxidase，简称POX或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶染色液(DAB法)是ICSH推荐采用的POX染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的DAB的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX所在部位。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX活性部位呈棕黄色。

自备材料：1、载玻片2、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA固定液，4℃固定30～60s，稍水洗。

2、滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min，水洗2min。

3、滴加WG染色液，孵育30～60s。

4、直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。

5、水洗、晾干、镜检。

染色结果：POX活性部位棕黄色细胞核蓝色粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。

浆细胞及巨核细胞均为阴性。

辣根过氧化物酶用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。

70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。

1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。

他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。

1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。

将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。

Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。

至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。

只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。

Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。

国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。

因此我们用HRP 法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。

建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。