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第五章凝集反应凝集反应第一节凝集反应的特点第二节直接凝集反应第三节间接凝集反应第四节自身红细胞凝集试验第五节抗球蛋白试验[讲义编号NODE70103200050100000001：针对本讲义提问]第一节凝集反应的特点细菌、红细胞等颗粒抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）在适当电解集反应。
可以进行半定量检测，即将抗体作一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。
凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阴性或阳性。
凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。
[讲义编号NODE70103200050100000101：针对本讲义提问]第二节直接凝集反应直接凝集反应的原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。
参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体则称为凝集素。
从方法上来讲，有玻片法和试管法两类。
（一）玻片凝集试验主要用于抗原的定性分析，短时间便能观察结果，一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类ABO血型的测定。
（二）试管凝集试验用定量抗原悬液与一系列梯度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，以判断待检血清中有无流行病原调查研究。
例如肥达试验、外斐试验、输血时也常用于受体和供体两者间的交叉配血试验。
[讲义编号NODE70103200050100000102：针对本讲义提问]第三节间接凝集反应间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电一、间接凝集反应的类型（一）正向间接凝集反应红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝反应，称为正向间接血凝反应（PHA）。
（二）反向间接凝集反应红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应（RPHA）。
[讲义编号NODE70103200050100000103：针对本讲义提问]（三）间接凝集抑制反应先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝间接血凝抑制试验可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。
医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。
BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
第五章（2）凝集反应Chapter 15 Agglutination Test第一部分教学内容和要求一、目的要求·掌握：凝集反应的原理、类型及临床应用；熟悉：凝集反应的技术要点、实验影响因素、方法评价、间接凝集常用的载体；了解：凝集反应各阶段的特征。
二、教学内容1。
凝集反应的特点与类型。
2。
直接凝集反应：玻片凝集试验，试管凝集试验。
3。
间接凝集反应：间接凝集反应的类型，间接血凝试验，胶乳凝集试验，间接凝集试验的临床应用。
4．自身红细胞凝集试验。
5．抗球蛋白试验。
第二部分测试题一、选择题（一）单项选择题（A型题）1．直接抗球蛋白实验用于检测A．血清中结合的抗体B．血清中游离的不完全抗体C．红细胞表面结合的不完全抗体D．红细胞表面结合的完全抗体E．血清中游离的完全抗体2．玻片凝集实验A．只能检测抗原，不能检测抗体B．既能检测抗原，又能检测抗体C．只能检测抗体，不能检测抗原D．为半定量实验E．不能用于ABO血型鉴定3。
下列哪一项不属于玻片凝集试验A。
菌种鉴定 B。
血清学分型 C。
人类ABO血型鉴定D．定量检测前筛选试验 E。
血清抗体效价测定4.试管凝集试验的效价判断标准是依据出现肉眼可见的如下凝集现象A．“+”B．“+或++”C．“++”D．“+++”E．“++++”5．间接抗球蛋白实验用于检测A．血清中结合的抗体B．血清中游离的不完全抗体C．红细胞表面结合的不完全抗体D．红细胞表面结合的完全抗体E．血清中游离的完全抗体6．协同凝集试验所用的载体是A．新鲜红细胞B．洗涤红细胞C．醛化红细胞D．聚苯乙烯颗粒E．金黄色葡萄球菌7．自身红细胞凝集试验红细胞是A．标准新鲜红细胞B．标准洗涤红细胞C．标准醛化红细胞D．受检者未致敏红细胞E．受检者致敏红细胞（二）多项选择题（X型题）1．实验中,促进凝集现象的措施有A．低温离心 B．增加电解质或蛋白质 C．加入右旋糖酐或葡聚糖D．用胰酶处理 E．加入抗原2。
第五章凝集反应细菌、红细胞等颗粒抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。
第一节凝集反应的特点凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阴性或阳性；也可进行半定量检测，即将抗体作一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。
凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。
第二节直接凝集反应一、原理细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。
参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体则称为凝集素。
二、方法有玻片法和试管法两类。
（一）玻片凝集试验主要用于抗原的定性分析，短时间便能观察结果。
一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类ABO血型的测定。
（二）试管凝集试验是用定量抗原悬液与一系列梯度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，以判断待检血清中有无相应抗体及其效价。
可以用来协助临床诊断或流行病原调查研究。
例如肥达试验、外斐试验、输血时也常用于受体和供体两者间的交叉配血试验。
第三节间接凝集反应一、原理间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。
二、间接凝集反应的类型（一）正向间接凝集反应可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应，称为正向间接凝集反应。
（二）反向间接凝集反应特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应，称为反向间接凝集反应。
（三）间接凝集抑制反应先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的载体颗粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向（或反向）间接凝集抑制试验。
间接凝集抑制试验可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。
（四）协同凝集反应协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）。
第五章间接凝集反应技术(Indirect agglutination reaction technique)一、概述（一）原理可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。
这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。
载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。
间接凝集反应的优点为：①敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；②快速：一般1h～2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；③特异性强；④使用方便、简单。
（二）载体具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。
良好载体有如下几点基本要求：①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；②大小均匀；③比重与介质相似，短时间内不能沉淀；④无化学或血清学活性；⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。
目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。
而后者应用更广，因为其来源方便。
另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。
（三）间接凝集的分类1．根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。
2．根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体）。
3．根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。
·1·4．根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。
二、间接炭凝反应（一）原理间接炭凝集反应简称炭凝。
它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。
目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。
（二）材料与试剂1．炭粉炭粉粒子最好大小在0.12mm～0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300目／寸的标准筛以300r／min离心去沉淀，再以3 000r／min 离心去上清，收集沉淀物。
2．高免血清3．待测标本4．灭活兔血清5．正常血清6．标准抗原7．0.05mol/L pH7.2PBS液8．1％硼酸的PBS液（三）操作方法1．炭致敏取湿炭粉0.25g（干粉0.10g），加入经56℃～60℃灭活30min的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37℃致敏30min，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS 液洗涤3次。
最后一次用含1％硼酸和1％兔血清的PBS液洗涤一次，离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。
同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。
致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4℃冰箱中保存，一年内有效。
2．取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小格，加被检标本0.10ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混匀，静止1min~5min，判定结果。
同时设三个对照：⑴免疫炭血清+标准抗原。
⑵正常炭血清+标准抗原。
·2·⑶正常炭血清加待检抗原。
（四）结果判定在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：“＋＋＋＋”：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。
“＋＋＋”：炭粉大部分凝集，液体透明。
“＋＋”：炭粉一半凝集，液体较透明。
“＋”：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。
“—”：炭粉不凝集，液体不透明。
炭凝以“＋＋”做为反应滴度的终点。
三、反向间接乳胶凝集反应（一）原理同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6μm～0.7μm的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性能。
间接乳胶凝集目前已用于鼠疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。
（二）材料与试剂1．聚苯乙烯乳胶2．免疫血清3．正常血清4．标准抗原5．待检抗原6．0.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液硼砂 6.67g硼酸8.04gH2O 加至 1 000ml7．生理盐水（三）操作方法1．乳胶液制备取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25倍稀释的乳胶液。
·3·2．乳胶致敏在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml～0.70ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。
镜下检查应无自凝。
使用时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。
加防腐剂后，于冰箱内保存。
注意防止冰冻。
同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。
3．取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。
（四）结果判定“＋＋＋＋”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。
“＋＋＋”：大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。
“＋＋”：半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。
“＋”：较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。
“－”：全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。
以“＋＋”作为该反应滴度的终点。
四、间接红血球凝集反应间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。
（一）原理以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。
将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。
用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。
许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。
（二）材料与试剂1．红血球2．反应板分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。
按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血清效价高1～2孔。
反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。
消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新洁尔灭及紫外线照射等。
·4·3．稀释棒由合金制成。
棒头有8条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。
它的作用是蘸取、转移、混合液体。
为了长期保持棒头的氧化层，每使用20次左右，应过火焰一次。
4．标准滴管每滴0.025ml。
5．微型振荡器6．兔血清盐水作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。
制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4℃保存。
同时，取所需量加4倍量的2.5％血球悬液，混匀，37℃水浴10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以pH7.2PBS 稀释成1％兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。
7．抗原尽可能使用高纯度的抗原。
8．供试血清或其它含抗体材料供试血清必须灭活，加9倍2.5％的红血球悬液，37℃水浴10min～20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1:10的血清稀释液。
9．醛化剂甲醛、戊二醛、丙酮醛等。
10．优质鞣酸11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于红血球致敏。
12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀释液。
13．0.02％牛血清白蛋白PBS液14．生理盐水（三）红血球的处理1．新鲜红血球新鲜红血球用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用。
采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出1～2个滴度。
但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。
为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。
2．红血球醛化极其优点（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。
甲醛醛化过程：①将红血球用pH7.2PBS反复洗涤4次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；②按1︰8的比例取红血球（压积）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀释，预先冷却至4℃），缓慢混合，加胶塞4℃作用24h，不时摇动；③倾去上清液，再以1︰2（V／V）加入36％～38％冷的（10℃）甲醛溶液，混匀，再放入4℃24h；④⑷离心去上清，以生理盐水反复洗涤4次。
彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10％悬液甲醛化红血球，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。
戊二醛醛化过程：①取新鲜红血球，以生理盐水洗涤4次；②以0.15Mol/L pH 7.2·5·PBS配成1％戊二醛溶液，4℃保存备用；③将100ml 1％冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；④离心去上清，以生理盐水洗涤4次，最后以PBS液（或生理盐水）配成10％悬液，加1／万硫柳汞，4℃保存。
丙酮醛—甲醛双醛化过程：①取新鲜红血球，洗涤4次，配成8％的悬液；②于红血球悬液中加等量的3％丙酮醛室温电磁搅拌16h～18h；③洗涤5次，再配成8％的悬液；④于红血球悬液中加等量的3％甲醛，电磁搅拌16h～18h；⑤洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的悬液，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。
（3）醛化红血球的优点：①性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；②重复性好，易标准化。
③可较长期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。
（4）影响醛化的因素：①红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；③醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37℃。
但有人认为应于4℃进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以3％醛化浓度为宜。
家禽红血球一般醛化1～2次即可，而哺乳动物红血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。
不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同，表5－1是各种双醛化法的结果比较。
脉冲／min是I标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。
但是从表5－1中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。
适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。
但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。
3．红血球鞣化多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。
但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。
有人认为双醛化后可不必进行鞣化。
首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和·6·不加鞣化得出相同的抗原滴度。
