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流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制PPT演示课件

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流式细胞仪介绍 ppt课件

流式细胞仪介绍 ppt课件
Source
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
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Belgium
Canada
China
France
Germany

流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制PPT演示课件

流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制PPT演示课件
4
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
5
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
54
设定分析群体
CD4 CD3
55
CD8 管分析
CD8
CD3
56
绝对计数公式
CD4 细胞数 内参微球数
# 获取微球数 X mL 全血体积
= CD4 细胞 mL 全血
57
绝对计数计算
举例
#2 #1
# 获取微球数
X
mL 全血
= CD4 细胞 mL 全血
CD4
CD3
58
绝对计数计算
质控微球
CD4
10035003500个细胞个细胞ulul48检测试剂盒组成检测试剂盒组成5050人份荧光试剂荧光试剂22个组合个组合人份cdcd44pecdpecd33pepecycy55cdcd88pecdpecd33pepecycy55固定液固定液效期效期22800cc储存储存66个月个月49质控试剂盒质控试剂盒5050人份效期效期2200cc储存储存11个月个月50使用简单方便使用简单方便安装简便一体式设计无需外源计算机安装简便一体式设计无需外源计算机即开即用无需调试校准即开即用无需调试校准全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体自动错误报警自动错误报警51实验报告实验报告cdcd33cdcd44cdcd88cdcd44cdcd88cdcd44cdcd33cdcd88cdcd33报告项目52自动设定分析区域cd3size53cd3cd4内参微球54设定分析群体cd3cd455cd3cd8cd8管分析56绝对计数公式cd4细胞数内参微球数获取微球数ml全血体积cd4细胞ml57举例获取微球数mlcd4细胞mlcd3cd4绝对计数计算58cd4质控微球59cd4tcd4t细胞检测的质量控制细胞检测的质量控制质量控制质量控制是指在每一次实验过程中为确保实验工是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施

九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制

九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制

免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）

Dynabeads技术计数CD4细胞

原理

用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
●流式细胞仪内部结构
▲光学系统 激光光源 光收集系统 ▲液流系统 流动室 液流驱动系统 ▲电子系统 光电转换 数据处理系统 ▲细胞分选系统


CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少
CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒臵，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损

外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度）

《流式细胞仪》课件

《流式细胞仪》课件

便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理

流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制

流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制

• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义

流式细胞术原理及应用简介PPT课件

流式细胞术原理及应用简介PPT课件
淋巴细胞亚群分析实验步骤 Forward Light Detector
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。

流式细胞术原理及应用ppt课件


•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
整理版课件
1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
整理版课件
42
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
整理版课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。

流式细胞术原理及应用 ppt课件

• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体

流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件

4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。

流式细胞仪分析技术及应用PPT课件

49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
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10
C D 4 ¸Ï û° ýÊ £¨ ö¸ / u l ©£
VL log copies/ml
350
333
300
309
250
266
200
150
165
100
50
0 d0
4w
12w
24w
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HAARTÖÎ ÁÆ 6¸ö Ô 10Àý »¼ Õß CD4ϸ °û ƽ ¾ù Êý ±ä »¯
7
成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
临床阶段
CD4+T细胞 A 无症状或急性HIV感 染或持续性全身淋巴结 肿大
B 出现症状， 不是A或C
C 艾滋病指针性症 状
>500/ul （≥29%）
A1
200-499/ul （14-28%）
A2
<200/ul （<14%）
A3
B1
C1
B2
6
5
4
3
2
1
0
d0
4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
11
12
提示
虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是 单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的 免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:
- 丙球蛋白缺乏症 - 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症) - 严重的联合免疫缺陷
6
CD4 T cells/ml
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptomatic phase AIDS
维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
3
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细 胞数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4绝对计数的原理、方法和 质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
1
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
T辅助/诱导细胞 CD3+CD4+
T抑制/细胞毒性细胞 CD3+CD8+
2
淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病
组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
9
确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程
CD4+T淋巴细 胞
病毒载量
建议
症状期
任何值
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 <200/mm3
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 >200/mm3，但
价格：3美元/人份
17
流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
18
●FCM的特点
保持细胞及细胞器或号 对细胞进行定量分析或纯化分选
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪 （ FACSCount、Guava)
3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议
用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于 1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。
15
非流式细胞技术
C2
B3
C3
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎 等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
8
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
13
CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
FCM 技术
优点
-简单 -低廉
缺点
-低通量 -难于质控
优点
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高 -高通量 -金标准技术
缺点
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
14
仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞 仪（ FACSCalibur、Coulter)
19
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
<350/mm3
>30000（bDNA）或 >55000(RT-PCR)
建议治疗。另外还要根据 CD4+T细胞下降率和患者的 愿望
无症状期
CD4+T细胞 >350/mm3
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治 <55000(RT-PCR) 疗者3年发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色）
细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
16
Dynabeads技术计数CD4细胞
原理 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞
方法 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
4
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
5
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。